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一文讀懂如何用Octet做分子垂釣

閱讀：1889 發(fā)布時(shí)間：2023/11/23

分子垂釣是生命科學(xué)研究中的一種常用技術(shù)，其基本原理就是從一個(gè)分子庫(例如某個(gè)細(xì)胞裂解液)釣取可以與配體結(jié)合的受體分子。通常情況下，我們先將配體固定在固相中，然后讓其與細(xì)胞裂解液中的分子進(jìn)行結(jié)合，最后將結(jié)合的受體洗脫并交由質(zhì)譜(MS)進(jìn)行鑒定。

　　基于生物層干涉技術(shù)(BLI)的Octet® 非標(biāo)記分子互作系統(tǒng)能夠快速、全自動(dòng)、多通道平行地測(cè)試濃度和動(dòng)力學(xué)常數(shù)。Octet® 的光纖生物傳感器可以通過多種方法固化配體，這不僅可以提供減少非特異性的良好固相，而且可以與質(zhì)譜(MS)進(jìn)行搭配使用，形成BLI-MS聯(lián)用技術(shù)。

　　圖1. BLI-MS的實(shí)驗(yàn)流程如下：

　　• 將生物傳感器浸入緩沖液中進(jìn)行平衡

　　• 將配體(例如抗體)固定到傳感器上

　　• 在用分析物基質(zhì)平衡后，將加載配體的生物傳感器浸入分析物溶液中進(jìn)行結(jié)合

　　• 經(jīng)過短暫洗滌后，將捕獲的分析物在低pH溶液中洗脫

　　• 重復(fù)進(jìn)行結(jié)合和洗脫步驟，在同一孔洗脫液洗脫并富集受體

　　• 通過LC-MS/MS消化和分析蛋白質(zhì)，從而鑒定分析物

　　BLI-MS技術(shù)的可行性需要解答以下幾個(gè)問題：

　　• 需要多少量的目標(biāo)蛋白才能進(jìn)行有效的垂釣？

　　• 釣出的背景蛋白數(shù)量是多少？

　　• 是否可以觀察到垂釣步驟的BLI信號(hào)？

　　• 如果一次垂釣洗脫量不足，需要重復(fù)垂釣幾次？

　　• 這個(gè)過程的成本是多少？操作是否復(fù)雜？

　　 接下來，我們就根據(jù)一篇相關(guān)文章[1]，和大家一起探討B(tài)LI做垂釣的可行性。

　　圖2. 垂釣方法開發(fā)思路：先從純蛋白垂釣鑒定蛋白量下限，再檢測(cè)高豐度和低豐度蛋白垂釣可行性

　　 BLI-MS可捕獲和鑒定重組GFP

　　將GFP抗體固化在鏈霉親和素(SA)傳感器上，并讓其與純的GFP進(jìn)行結(jié)合。通過LC-MS/MS方法對(duì)洗脫液進(jìn)行鑒定，可以確認(rèn)GFP已被成功捕獲并從生物傳感器中洗脫出來。GFP的MS信號(hào)強(qiáng)度與所用GFP的濃度成比例增加，檢測(cè)閾值為0.63 nM，這意味著僅需3.38 ng的GFP就可以被垂釣和鑒定出來。這個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證了Octet® 進(jìn)行垂釣的可行性。

　　 圖3. 左上圖：LC-MS /MS分析后，各濃度生物傳感器洗脫液中的GFP蛋白MS1強(qiáng)度；

　　右上圖：對(duì)數(shù)MS信號(hào)強(qiáng)度和濃度曲線圖；

　　下圖：使用Skyline提取的一種GFP肽(FEGDTLVNR)的離子色譜提取(XIC)信號(hào)

　　 BLI-MS可以捕獲和鑒定細(xì)胞裂解物中帶有GFP標(biāo)簽的蛋白質(zhì)

　　為了在復(fù)雜的生物樣品中測(cè)試BLI-MS方案，該研究使用Octet® 從表達(dá)融合蛋白胱氨酸素-GFP的小鼠成纖維細(xì)胞的細(xì)胞裂解物中垂釣GFP標(biāo)記的蛋白質(zhì)。使用固化GFP抗體的傳感器，垂釣總蛋白100 μg、10 μg和 1 μg的裂解物，分別用30 個(gè)和 10 個(gè)結(jié)合/洗脫循環(huán)。文章設(shè)置了兩個(gè)陰性對(duì)照：

　　 i 　固化非相關(guān) IgG 的生物傳感器，從表達(dá)融合蛋白的細(xì)胞中捕獲細(xì)胞裂解物

　　 ii 　使用裝載有GFP抗體的生物傳感器，從轉(zhuǎn)染EV(Empty Vector)的細(xì)胞中捕獲細(xì)胞裂解物(不含GFP)

　　在 100 μg ，10 μg裂解物的 BLI-MS 實(shí)驗(yàn)中，我們觀察到了明顯的GFP融合蛋白的BLI信號(hào)，而兩個(gè)陰性對(duì)照沒有，這說明有GFP蛋白已被成功垂釣出來。經(jīng)過LC-MS/MS分析，我們?cè)谒嘘栃詷悠分卸紮z測(cè)到GFP，而兩個(gè)陰性對(duì)照則沒有，這進(jìn)一步說明了Octet® 做為一種垂釣方法的良好特異性。隨著循環(huán)數(shù)的增加和總蛋白量的增多，GFP信號(hào)增強(qiáng)，但同時(shí)背景蛋白數(shù)量也會(huì)增多。綜合考慮，可以選擇300 μg總蛋白量和10個(gè)循環(huán)的富集(耗費(fèi)約1個(gè)小時(shí))。

　　圖4. 使用Octet®從總細(xì)胞裂解物中分離GFP融合蛋白結(jié)果

　　Octet®傳感圖顯示：含有總蛋白100 μg(A)、10 μg(B)和1μg(C)成纖維細(xì)胞裂解物中，實(shí)時(shí)鑒定垂釣GFP 融合蛋白的情況

　　直方圖顯示：在進(jìn)行1個(gè)和30個(gè)循環(huán)(D、E、F)后，對(duì)洗脫液進(jìn)行LC-MS/MS分析后GFP的MS1強(qiáng)度

　　堆積面積圖顯示：100 個(gè)和 10 個(gè)循環(huán)后從總蛋白1 μg(G)、30 μg(H)和 10 μg(I) 成纖維細(xì)胞裂解物中鑒定出的背景蛋白數(shù)量

　　 BLI-MS可從脾細(xì)胞裂解物中捕獲和鑒定內(nèi)源性CD16a

　　為了測(cè)試BLI-MS在復(fù)雜生物樣品中捕獲和鑒定內(nèi)源性蛋白質(zhì)性能，研究嘗試從300 μg人脾細(xì)胞裂解物中垂釣CD16a。陰性對(duì)照是固化無關(guān) IgG 的生物傳感器。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

　　在三次實(shí)驗(yàn)中，CD16a抗體包被的生物傳感器上均有明顯的BLI信號(hào)，說明有物質(zhì)被釣出。經(jīng)過LC-MS/MS分析，可以在陽性樣品中檢測(cè)到CD16a，而三份陰性樣品中未檢測(cè)到CD16a。相對(duì)于高豐度樣品，雖然組織裂解物的蛋白背景更多，但是扣除陰性對(duì)照的蛋白后，陽性樣品可以鑒定出10種特異結(jié)合的蛋白質(zhì)，其中CD16a豐度最高，進(jìn)一步說明了Octet® 用于垂釣的高度特異性。