【技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)解析】CDE納米藥物質(zhì)量控制研究技術(shù)指導(dǎo)原則解讀(一)
【技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)解析】CDE納米藥物質(zhì)量控制研究技術(shù)指導(dǎo)原則解讀(一)
#本文由馬爾文帕納科應(yīng)用專家張鵬博士供稿#
為規(guī)范和指導(dǎo)納米藥物研究與評價,在國家藥品監(jiān)督管理局的部署下,藥審中心組織制定了《納米藥物質(zhì)量控制研究技術(shù)指導(dǎo)原則(試行)》、《納米藥物非臨床藥代動力學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則(試行)》《納米藥物非臨床安全性評價研究技術(shù)指導(dǎo)原則(試行)》三項關(guān)于納米藥物研究、質(zhì)控、評價的技術(shù)指導(dǎo)原則。并由經(jīng)國家藥品監(jiān)督管理局審查同意,8月27日予以發(fā)布通告,三項技術(shù)指導(dǎo)原則自發(fā)布之日起開始施行。
其中《納米藥物質(zhì)量控制研究技術(shù)指導(dǎo)原則》主要內(nèi)容是圍繞著納米藥物的安全性、有效性以及質(zhì)量可控性展開的。在這3方面,質(zhì)量的可控性顯得尤為重要,它一定程度上決定了藥物的安全性和有效性。
該指導(dǎo)原則進一步將納米藥物細(xì)分為三類:藥物納米粒、載體類納米藥物以及其他類納米藥物,前兩類藥物適用于該指導(dǎo)原則。
在研發(fā)過程中,納米藥物的質(zhì)量控制指標(biāo)又可以分為納米相關(guān)特性和制劑基本特性兩大類。其中納米相關(guān)特性是可能與藥物在體內(nèi)行為息息相關(guān)的重要質(zhì)量指標(biāo)。又包括例如平均粒徑及其分布、納米粒結(jié)構(gòu)特征、微觀形態(tài)、表面性質(zhì)(電荷、比表面積等)包封率、載藥量、納米粒濃度、納米粒穩(wěn)定性等等。
質(zhì)量控制指標(biāo)涉及方面較多,本文重點關(guān)注以下三個方面的指標(biāo):
1. 粒徑(平均粒徑及其分布)
2. 表面電荷
3. 納米粒濃度
在粒徑表征方面,該指導(dǎo)意見原文如下:
“應(yīng)選擇適當(dāng)?shù)臏y定方法對納米藥物的粒徑及分布進行研究,并進行完整的方法學(xué)驗證及優(yōu)化。粒徑及分布通常采用動態(tài)光散射法(Dynamic light scattering,DLS)進行測定,需要使用經(jīng)過認(rèn)證的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(Certified reference material,CRM)進行校驗,測定結(jié)果為流體動力學(xué)粒徑(Rh),粒徑分布一般采用多分散系數(shù)(Polydispersity index,PDI)表示。除此之外,顯微成像技術(shù)(如透射電鏡(Transmission electron microscopy,TEM)、掃描電鏡(Scanning electron microscopy,SEM)和原子力顯微鏡(Atomic force microscopy,AFM)、納米顆粒跟蹤分析系統(tǒng)(Nanoparticle tracking analysis, NTA)、小角X射線散射(Small-angle X-ray scattering,SAXS)和小角中子散射(Small-angle neutron scattering,SANS)等也可提供納米藥物粒徑大小的信息。對于非單分散的樣品,可考慮將粒徑測定技術(shù)與其它分散/分離技術(shù)聯(lián)用。”
在了解動態(tài)光散射技術(shù)(DLS)之前,我們先來講一講粒徑測量時的“等效球體”的概念。
想象一下,當(dāng)我們完成顆粒粒徑測試后,該如何用準(zhǔn)確的數(shù)值來描述這些三維顆粒的大小呢?當(dāng)顆粒是規(guī)則的形狀時,比如說正方體、球體,我們可以用一個數(shù)值,例如:邊長、直徑,來表示這個顆粒的大?。坏?,當(dāng)顆粒呈現(xiàn)的形貌是無規(guī)則的話,我們就無法用一個數(shù)值來描述這個顆粒大小了,那有人會說,用一系列數(shù)值來描述這些顆粒不就行了嗎,這個方法確實可行,但是隨之帶來了數(shù)據(jù)呈現(xiàn)的復(fù)雜度以及顆粒粒徑大小比較的困難度。這個時候我們就必須引入“等效球體”概念了。
什么叫做等效球體呢?
當(dāng)我們通過某種技術(shù)測量顆粒在某一方面的性質(zhì),并得到了一個具體的數(shù)值,如果一個剛性球體在該性質(zhì)方面的數(shù)值和前者一樣,那么我們就認(rèn)為待測物的顆粒大小和這個剛性球的大小一致。
等效球體概念在粒徑上的應(yīng)用既能滿足準(zhǔn)確表示待測顆粒的粒徑大小,又能使得這些數(shù)值能夠被用來進行大小比較(單個數(shù)值)。
如圖1所示,我們可以得知,當(dāng)一個不規(guī)則的顆粒采用不同的測量技術(shù)(沉降法、電阻法、體積法等等)去進行測量時,往往會得到不同的粒徑值。
而我們說的動態(tài)光散射技術(shù)測量的是顆粒的擴散速度,所以,具有同樣大小擴散速度的剛性球體的直徑就是待測顆粒的粒徑大小,我們一般稱之為流體力學(xué)直徑。
動態(tài)光散射
接著我們進一步來了解一下什么是DLS技術(shù):
分散在溶液相的納米顆粒由于受到溶劑分子的撞擊,呈現(xiàn)出無規(guī)則的運動,我們稱之為布朗運動(Brownian motion),如果我們將一束激光照射至含有該納米顆粒的溶液中,溶液相中的顆粒會產(chǎn)生散射光,隨后在一定的角度收集相關(guān)的散射光,我們就能得到如圖2所示的散射光強隨時間的變化曲線,可以看出大顆粒布朗運動較為緩慢,散射光強的變化頻率較慢(圖2,上)。小顆粒則相反,由于其布朗運動劇烈,接收到的散射光強的變化頻率較快(圖2,下)。
而動態(tài)光散射技術(shù)則可以捕獲上述散射光變化的頻率,進而獲得顆粒的布朗運動速率大小,最后通過反演算法獲得顆粒的粒徑和分布。
根據(jù)斯托克斯-愛因斯坦方程(Stokes-Einstein)的定義,我們可以看出,顆粒的運動速率是和它的粒徑成反比的,運動速率越快,粒徑越小,運動速率越慢,粒徑越大。
該方程式:DH=KT/3πηD
K:玻爾茲曼常數(shù)
T:整個體系的絕對溫度值
η:溶劑粘度值
D:顆粒平動擴散系數(shù)
那具體如何獲得顆粒的布朗運動速率(D)呢?
接下來我們要引入“相關(guān)性”這個概念,如圖3所示,如果我們將t時刻的散射光強度和其后較長時間的散射光強相比較,顯然,他們沒有什么相關(guān)性。但是,當(dāng)我們將時間縮短到很短時間范圍內(nèi),也就是將t和t+δt時刻的光強值進行比較,就能得到很強的相關(guān)性,隨著時間的增加(δt, 2δt, 3δt, 等等),其散射光強值和t時刻的相關(guān)性不斷衰減,最后接近0值,相關(guān)性通常用數(shù)值來描述(1→0),數(shù)值越靠近“1”代表相關(guān)性非常高,越接近“0”代表相關(guān)性很低。δt的時間非常短,一般在納秒(nanosecond,ns)或者微秒(microsecond,μs)。
散射光強在不同時間點的相關(guān)性我們用G (τ)來表示:G (τ)=A[1+Bexp (-2Γτ)]
τ代表著信號采集滯后時間
Γ=Dq2,
q=(4πn/λ0) sin(θ/2),散射矢量
D:顆粒平動擴散系數(shù)
n:溶液的折光指數(shù)
λ0:入射光波長
θ:散射光接收角度
最后,我們用相關(guān)方程來描述這種相關(guān)性隨時間的變化(圖4),大顆粒的散射光強的相關(guān)性隨時間變化慢,信號衰減慢(左),小顆粒的散射光強的相關(guān)性隨時間變化快,信號衰減快(右)。
聊完了DLS的基本原理,我們再來看看大家比較關(guān)注的幾個問題:
1. 什么是Z-average size(平均粒徑)、PI(polydispersity index,多分散指數(shù))?
Z-average size表示樣品中顆粒的平均粒徑大小,根據(jù)ISO 13321:1996,我們可以知道,該數(shù)據(jù)是通過累計分析法得到的。
PI代表著樣品的粒徑分布寬度,數(shù)值越小,說明體系里的粒徑大小越一致,數(shù)值越大,說明體系里的粒徑分布群體越多,粒徑分布較寬,一般我們認(rèn)為當(dāng)PI值大于0.7時,表示這個體系不再適合用DLS這種技術(shù)進行表征了。
除了平均粒徑和PI,我們還能得到顆粒的光強粒徑分布圖,在這個分布圖里,我們能得到不同粒徑下對應(yīng)的散射光強占比數(shù)據(jù),這些分布圖是根據(jù)分布算法得到的。
2. 如何看待不同測量角度下得到的粒徑數(shù)據(jù)?
市面上主要存在兩種測量角度的納米粒度儀,分別是90°和173°,前者我們稱之為側(cè)向角,后者我們稱之為背向角。
當(dāng)測試的樣品為粒徑窄分布時,例如聚苯乙烯標(biāo)準(zhǔn)樣品,兩種測量角度都能得到很好的粒徑分布圖,結(jié)果也非常一致(圖5)。
當(dāng)測試的樣品為粒徑寬分布時,比如一些生物樣品,兩種測量角度得到的粒徑分布圖就會有區(qū)別(見圖6)。
這是為什么呢?
這其實是和顆粒的散射性質(zhì)有關(guān)系的,當(dāng)顆粒的粒徑大小小于入射波段的1/10時,顆粒在各個方向上的散射光強度都一樣,我們稱之為各向同性,那么在這兩個角度上進行測量,都能得到正確的數(shù)值。但是隨著顆粒粒徑的增加,顆粒在各個方向上的散射光強開始變得不一致,越靠近0度角,其散射光強增加越強烈,我們稱之為各向異性。在絕大多數(shù)情況下,不同粒徑的顆粒其散射強度在90°要比在173°要強一些,當(dāng)體系中大顆粒開始變多時,來自于大顆粒的散射光強貢獻(xiàn)度在90°角下就會比在173°角下要更多,因為粒徑分布的數(shù)據(jù)是根據(jù)不同粒徑的散射光強在整個體系的占比中得到的,所以在90°角下會使得顆粒的粒徑分布更容易傾向于體系中存在的大顆粒。