本生闡述Elisa試劑盒實驗洗板前準(zhǔn)備流程
一、ELISA操作前準(zhǔn)備工作
試劑盒的選擇
ELISA操作前,應(yīng)做好實驗的設(shè)計、選擇適合自己檢測范圍和靈敏度的試劑盒、提前訂購和準(zhǔn)備試劑及耗材、處理樣本等準(zhǔn)備工作。
樣本處理
在收集標(biāo)本前需有一個完整的計劃,需要清楚要檢測的成份是否足夠穩(wěn)定。ELISA檢測提倡新鮮標(biāo)本盡早檢測,對收集后當(dāng)天就進(jìn)行檢測的標(biāo)本,及時儲存在4℃?zhèn)溆?,如有特殊原因需要周期收集?biāo)本,請取材后,將標(biāo)本及時分裝后放在-20℃或-70℃條件下保存。因冰室與室溫存在一定溫差,蛋白極易降解,直接影響實驗質(zhì)量,所以避免反復(fù)凍融。
二、ELISA標(biāo)準(zhǔn)品溶解
標(biāo)準(zhǔn)品是試劑盒的檢測抗原的一個度量標(biāo)尺,因此標(biāo)準(zhǔn)品的溶解、倍比稀釋和保存要特別注意以下細(xì)節(jié):凍干標(biāo)準(zhǔn)品溶解按照說明書的要求,準(zhǔn)確復(fù)溶。在冰上操作標(biāo)準(zhǔn)品為佳,靜止5-10分鐘,輕輕搖勻后按照一次量分裝,在-20度或-70度保存。標(biāo)準(zhǔn)品嚴(yán)禁反復(fù)凍融。標(biāo)準(zhǔn)品的倍比稀釋應(yīng)事先做好準(zhǔn)備,如離心管的準(zhǔn)備和編號以及稀釋液的準(zhǔn)備;稀釋時,應(yīng)充分混勻;采用進(jìn)口或者硅化的EP管,減少蛋白吸附。在實驗孔內(nèi)進(jìn)行倍比稀釋時,注意操作規(guī)范,槍頭勿刮劃預(yù)包被的孔底。
三、ELISA操作中的洗滌
洗滌是ELISA實驗中是次數(shù)多的操作,也是非常重要的步驟。不嚴(yán)格的洗滌容易出現(xiàn)洗不干凈或交叉污染現(xiàn)象,實驗重復(fù)效果差的現(xiàn)象。不管用多道加樣器、洗瓶、吸管,還是洗板機,嚴(yán)格按照說明書操作不要減少步驟洗滌的洗滌體積、洗滌時間和洗滌次數(shù)。注意標(biāo)準(zhǔn)化操作將減少實驗誤差和不同實驗之間的誤差。操作者常出現(xiàn)洗板不干凈現(xiàn)象,請比照“手工洗板小貼士"操作:
a)洗液不要溢出孔外,以免污染相鄰的孔,特別是每次洗板的前兩遍,若高濃度的孔污染了低濃度的孔或空白孔,其造成的交叉污染的孔是洗不掉的,背景肯定會增高。
b)特別注意:設(shè)計實驗的時候要考慮實驗孔的位置,保證甩掉洗液時,空白孔、低濃度孔或陰性對照組在上面或一側(cè)或分開更好。同時注意甩掉洗液的動作翻轉(zhuǎn)(從正上方旋轉(zhuǎn)120-150度)要迅速、干脆。甩板不要手腕左右搖擺、旋轉(zhuǎn)來甩液體!甩出后以直線方式補2-3次甩出液體。
c)用干凈的濾紙,不要用衛(wèi)生紙,因為細(xì)小粉塵或者碎屑容易吸附到孔底,導(dǎo)致洗板不干凈,結(jié)果偏高或偏低,重復(fù)孔的數(shù)值也會相差很大。
d)每次拍板不要重復(fù)在一個地方拍,特別是洗去酶的步驟;拍板不宜過輕,否則拍不干凈,拍板很用力不會對蛋白有什么影響。但注意不要太重,以至把板條給拍斷。每次洗板后輕叩幾下,最后一次一定要扣干凈。
e)不能減少洗液體積、洗板時間和次數(shù)。洗板時間太短,洗板效果不佳。延長洗板時間和增加洗板次數(shù)可以使背景更干凈。
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