酶的分離純化方法簡(jiǎn)介

生物細(xì)胞產(chǎn)生的酶有兩類：一類由細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生后分泌到細(xì)胞外進(jìn)行作用的酶，稱為細(xì)胞外酶。這類酶大都是水解酶，如酶法生產(chǎn)葡萄糖所用的兩種淀粉酶，就是由枯草桿菌和根酶發(fā)酵過(guò)程中分泌的。這類酶一般含量較高，容易得到；另一類酶在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生后并不分泌到細(xì)胞外，而在細(xì)胞內(nèi)起催化作用，稱為細(xì)胞內(nèi)酶，如檸檬酸、肌苷酸、味精的發(fā)酵生產(chǎn)所進(jìn)行的一系列化學(xué)反應(yīng)，就是在多種酶催化下在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行的，在類酶在細(xì)胞內(nèi)往往與細(xì)胞結(jié)構(gòu)結(jié)合，有一定的分布區(qū)域，催化的反應(yīng)具有一定的順序性，使許多反應(yīng)能有條不紊地進(jìn)行。
      酶的來(lái)源多為生物細(xì)胞。生物細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的總的酶量雖然是很高的，但每一種酶的含量卻很低，如胰臟中期消化作用的水解酶種類很多，但各種酶的含量卻差別很大。
因此，在提取某一種酶時(shí)，首先應(yīng)當(dāng)根據(jù)需要，選擇含此酶zui豐富的材料，如胰臟是提取胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、淀粉酶和脂酶的好材料。由于從動(dòng)物內(nèi)臟或植物果實(shí)中提取酶制劑受到原料的限制，如不能綜合利用，成本又很大。目前工業(yè)上大多采用培養(yǎng)微生物的方法來(lái)獲得大量的酶制劑。從微生物中來(lái)生產(chǎn)酶制劑的優(yōu)點(diǎn)有很多，既不受氣候地理?xiàng)l件限制，而且動(dòng)植物體內(nèi)酶大都可以在微生物中找到，微生物繁殖快，產(chǎn)酶量又豐富，還可以通過(guò)選育菌種來(lái)提高產(chǎn)量，用廉價(jià)原料可以大量生產(chǎn)。
      由于在生物組織中，除了我們所需要的某一種酶之外，往往還有許多其它酶和一般蛋白質(zhì)以及其他雜質(zhì)，因此為制取某酶制劑時(shí)，必須經(jīng)過(guò)分純化的手續(xù)。
酶是具有催化活性的蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)很容易變性，所以在酶的提純過(guò)程中應(yīng)避免用強(qiáng)酸強(qiáng)堿，保持在較低的溫度下操作。在提純的過(guò)程中通過(guò)測(cè)定酶的催化活性可以比較容易跟蹤酶在分離提純過(guò)程中的去向。酶的催化活性又可以作為選擇分離純化方法和操作條件的指標(biāo)，在整個(gè)酶的分離純化過(guò)程中的每一步驟，始終要測(cè)定酶的總活力和比活力，這樣才能知道經(jīng)過(guò)某一步驟回收到多少酶，純度提高了多少，從而決定著一步驟的取舍。

      酶的分離純化一般包括三個(gè)基本步驟：即抽提、純化、結(jié)晶或制劑。首先將所需的酶從原料中引入溶液，此時(shí)不可避免地夾帶著一些雜質(zhì)，然后再將此酶從溶液中選擇性地分離出來(lái)，或者從此溶液中選擇性地除去雜質(zhì)，然后制成純化的酶制劑。下面就酶的分離純化的常用方法作一綜合介紹：
一、預(yù)處理及固液分離技術(shù)
1.細(xì)胞破碎（cell disruption）
高壓均質(zhì)器法：此法可用于破碎酵母菌、大腸菌、假單胞菌、桿菌甚至黑曲霉菌。將細(xì)胞懸浮液在高壓下通入一個(gè)孔徑可調(diào)的排放孔中，菌體從高壓環(huán)境轉(zhuǎn)到低壓環(huán)境，細(xì)胞就容易破碎。菌懸液一次通過(guò)均質(zhì)器的細(xì)胞破碎率在12%-67%。細(xì)胞破碎率與細(xì)胞的種類有關(guān)。要達(dá)到90%以上的細(xì)胞破碎率，起碼要將菌懸液通過(guò)均質(zhì)器兩次。是提高操作壓力，減少操作次數(shù)。但有人報(bào)道，當(dāng)操作壓力達(dá)到175Mpa時(shí)，破碎率可達(dá)100%。當(dāng)壓力超過(guò)70Mpa時(shí)，細(xì)胞破碎率上升較為緩慢。高壓均質(zhì)器的閥門是影響細(xì)胞破碎率的重要因素。絲狀菌會(huì)堵塞均質(zhì)器的閥門，尤其高濃度菌體時(shí)更是如此。在豐富培養(yǎng)基上比在合成培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的大腸菌更難破碎。
      容菌酶處理法：蛋清中含有豐富的溶菌酶，價(jià)格便宜，常用來(lái)裂解細(xì)胞。具體做法是：溶壁微球菌（micrococcus lysodeikticus）43kg，置于0.5%的氯化鈉溶液中，使細(xì)胞濃度為5%（干重），在35℃用0.68kg（干重）的蛋清處理20min，得到的細(xì)胞碎片用相同體積的乙醇處理，用離心機(jī)將細(xì)胞碎片和胞內(nèi)蛋白質(zhì)除去，再將乙醇濃度提高到75%（體積分?jǐn)?shù)），可以得到純度為5%的過(guò)氧化氫酶1500g。
2.離心
      離心分離過(guò)程可分為離心過(guò)濾、離心沉淀、離心分離3種類型，所使用的設(shè)備有過(guò)濾式離心機(jī)、沉降式離心機(jī)和離心機(jī)。過(guò)濾式離心機(jī)的轉(zhuǎn)鼓壁上開(kāi)有小孔，壁上有過(guò)濾介質(zhì)，一般可用于處理懸浮固體顆粒較大、固體含量較高的場(chǎng)合。沉降式離心機(jī)用于分離固體濃度較低的固液分離，如發(fā)酵液中的菌體，用鹽析法或有機(jī)溶劑處理過(guò)的蛋白質(zhì)等。分離機(jī)用于分離兩種互不相溶的、密度有微小差別的乳濁液或含微量固體微粒的乳濁液。
      在生物領(lǐng)域采用的離心機(jī)系統(tǒng)，除了應(yīng)具備離心機(jī)的一般要求外，還應(yīng)滿足生物生產(chǎn)的技術(shù)要求，這包括滅菌、冷卻、密封，以保證產(chǎn)品不受污染并不污染環(huán)境。現(xiàn)代哦離心機(jī)裝置包括以下三個(gè)步驟，并進(jìn)行程序控制：離心、離心系統(tǒng)的滅菌及就地清洗。如阿法-拉伐公司離心機(jī)產(chǎn)品的裝置，具有雙重軸向密封，密封由裝在轉(zhuǎn)筒主軸上下的碳化硅動(dòng)環(huán)和固定環(huán)組成，密封由水連續(xù)冷卻和潤(rùn)滑，可防止產(chǎn)品被污染，也可防止生產(chǎn)過(guò)程中排出的廢物對(duì)環(huán)境的污染。該離心機(jī)又如一個(gè)密閉的壓力容器，可在121℃溫度下進(jìn)行蒸汽滅菌，該離心設(shè)備設(shè)有環(huán)繞離心機(jī)轉(zhuǎn)筒的冷卻夾套，對(duì)懸浮液和濃縮的固體都能進(jìn)行充分的冷卻，并能有效地控制溫度，這對(duì)于生物制品是非常重要的。如BTPX205型離心機(jī)可用于細(xì)胞收集、培養(yǎng)液的凈化和細(xì)胞碎片的分離，可用于疫苗、酶制劑等的提取。該機(jī)的其他輔助系統(tǒng)及控制系統(tǒng)也較為完善，如設(shè)有壓力指示器、力量計(jì)、溫度傳感器和液面?zhèn)鞲衅鳌?br />3.膜分離技術(shù)
      在蛋白質(zhì)純化過(guò)程中主要用到的膜分離技術(shù)多為超濾。在靜壓作用下降溶液通過(guò)孔徑非常小的濾膜，使溶液中分子量較小的溶質(zhì)透過(guò)薄膜，而大分子被截留于膜表面。大多數(shù)超濾膜是由一層非常薄的功能膜與較厚的支撐膜結(jié)合在一起而組成的。功能膜決定了膜的孔徑，而支撐膜提供機(jī)械強(qiáng)度以抵抗靜壓力。超濾濃縮的優(yōu)點(diǎn)是：操作條件溫和，無(wú)相變化，對(duì)生物活性物質(zhì)沒(méi)有破壞。
超濾系統(tǒng)主要由料液貯罐、泵、超濾器、透過(guò)液收集罐組成，料液經(jīng)泵打入超濾器，水及低分子量物質(zhì)排出超濾器外，被濃縮的料液在料液貯罐、泵、及超濾器中循環(huán)。當(dāng)料液濃縮至一定的倍數(shù)后即可作為進(jìn)一步處理的濃縮料液。
      超濾應(yīng)用于蛋白質(zhì)類物質(zhì)的濃縮和脫鹽過(guò)程中時(shí)應(yīng)注意以下問(wèn)題：*，在超濾循環(huán)過(guò)程中，由于泵和葉輪與料液的摩擦放熱作用，料液的溫度會(huì)逐漸升高，會(huì)造成蛋白質(zhì)分子的損失。因此，料液貯罐應(yīng)加冷卻系統(tǒng)，并安裝自動(dòng)測(cè)溫及控制系統(tǒng)。第二，某些酶的輔助因子散失為問(wèn)題：一些酶含有輔助因子，其分子量小，超濾時(shí)易從透過(guò)液中排除掉，因而在超濾前或超濾后要添加一定濃度的的輔助因子。
      還可將超濾與親和層析相結(jié)合以提高分離純度。其工作原理是：當(dāng)溶液中欲被分離的蛋白質(zhì)不受阻礙地通過(guò)超濾膜的孔隙時(shí)，如果在膜的一側(cè)結(jié)合著親和配基，該蛋白質(zhì)就會(huì)與配基結(jié)合因而結(jié)聚在膜的這一側(cè)。不與配基結(jié)合的其他物質(zhì)就將穿過(guò)孔而被帶走。再用適宜的洗脫劑將該蛋白質(zhì)洗脫下來(lái)，洗脫液用于進(jìn)一步的分離純化。
4.泡沫分離
原理：將氣體通入含多種組分的溶液中，由于這些組分的表面活性由差異，因此在溶液的表面，某些組分將形成泡沫，泡沫的穩(wěn)定性取決于操作條件及溶液的生物學(xué)特性。泡沫中含有更多的表面活性成分，故泡沫的組分種類及其含量與溶液中的不相同。這樣，溶液中的組分舅得以分離。
蛋白質(zhì)較易吸附與氣液界面，這有利于其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。泡沫分離過(guò)程是：蛋白質(zhì)從主體溶液中擴(kuò)散到氣液界面，該過(guò)程可能是可逆的也可能是不可逆的；分子發(fā)生重排，一般認(rèn)為在空氣-水界面會(huì)形成兩種類型的膜，一種是稀膜，另一種是濃膜，可能會(huì)發(fā)生由多個(gè)分子聚集在一起的現(xiàn)象。在氣液界面形成的蛋白質(zhì)膜可以是單層的也可以是多層的。膜的類型取決于主體溶液及氣液界面上蛋白質(zhì)的特性、結(jié)構(gòu)和濃度。
      泡沫分離的目的，一方面提高酶蛋白的富集率（泡沫中蛋白質(zhì)的濃度/zui初溶液中蛋白質(zhì)濃度），另一方面提高酶蛋白的提取率（泡沫中蛋白質(zhì)的提取率/zui初的蛋白質(zhì)質(zhì)量），或使多組分混合物中某一組分的分配系數(shù)zui大。

二、抽提
沉淀
1.        鹽析
      常用的鹽析劑是硫酸銨，其溶解度大、價(jià)格便宜。硫酸銨沉淀蛋白質(zhì)的能力很強(qiáng)，其飽和溶液能使大多數(shù)的蛋白質(zhì)沉淀下來(lái)。對(duì)酶沒(méi)有破壞作用。
      pH的控制：應(yīng)從酶的溶解度與穩(wěn)定性兩個(gè)方面考慮，在酶等電點(diǎn)時(shí)其溶解度zui小易沉淀，但有些酶再等電點(diǎn)時(shí)穩(wěn)定性較差，因此要選擇*pH值.一般要求在酶zui穩(wěn)定的pH值的前提下再考慮zui適宜酶沉淀的pH值。在操作中一旦確定*pH值后，在添加硫酸銨之前甲酸或堿調(diào)節(jié)好酶液的pH值，要盡量避免溶液pH值的波動(dòng)以免破壞酶的穩(wěn)定性。在添加硫酸銨時(shí)要注意攪拌，并注意硫酸銨的加入速度，一般是由少到多，緩慢加入，硫酸銨盡可能磨成細(xì)粉。
     溫度的控制：有些酶在較高溫度下穩(wěn)定性能較好，可在常溫下進(jìn)行鹽析操作，而對(duì)于大多數(shù)酶，盡可能在低溫下操作。
     酶液的凈置：加完硫酸銨后，酶液要靜置一段時(shí)間，使酶蛋白*沉淀下來(lái)，酶靜置后，就不要再加以攪拌。
2．有機(jī)溶劑沉淀
      有機(jī)溶劑選擇：可用于酶蛋白沉淀的有機(jī)溶劑包括醇類物質(zhì)等，如甲醇、乙醇、異丙醇。乙醇的親水性能較好，可防止蛋白質(zhì)的變性，酶蛋白在其中的溶解度也較低。
有機(jī)溶劑沉淀操作：有機(jī)溶劑一般都使蛋白質(zhì)變性，當(dāng)溫度較高時(shí)變性蛋白質(zhì)分子就會(huì)變成*失活。因此用有機(jī)溶劑處理時(shí)在0℃以下進(jìn)行。用有機(jī)溶劑沉淀得到的酶蛋白不要放置過(guò)久，要盡快加水溶解。
3.聚合物絮凝劑沉淀
      聚合物絮凝劑，如葡聚糖和聚乙二醇，與酶分子爭(zhēng)奪水分子，具有脫水作用使酶沉淀。聚乙二醇作為一種沉淀劑的優(yōu)點(diǎn)是在水溶液中，其濃度可達(dá)到50%，濃度為6%-12%的蛋白質(zhì)大都可以沉淀下來(lái)。這種試劑不需要低溫操作，而且對(duì)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定還有一定的保護(hù)作用。聚乙二醇不會(huì)被吸附，故在離子交換吸附前不必去除。
4．用金屬離子和絡(luò)合物沉淀
      酶和其他蛋白質(zhì)都會(huì)形成金屬鹽，其溶解度較低。用金屬離子沉淀的缺點(diǎn)是酶與金屬離子相互作用后，可逆變化較差，尤其是用巰基衍生物，它結(jié)合的]金屬離子會(huì)催化酶變性而失活。
5．用特殊試劑沉淀法
      用鏈霉素可選擇性去除核酸，從而使胞內(nèi)酶沉淀出來(lái)。鏈霉素鹽（濃度為0.5-1.0mg/mg蛋白質(zhì)）對(duì)于選擇性沉淀核酸的效果比錳離子還要好，酶不易失活。
6．親和沉淀
      將親和反應(yīng)的高度選擇性、低處理量特性與沉淀操作的大處理量、地選擇性有機(jī)結(jié)合形成了親和沉淀技術(shù)。將配基與可溶性載體偶聯(lián)后形成載體-配基復(fù)合物，該復(fù)合物與生物分子結(jié)合后在一定條件下可以沉淀出來(lái)。
      配基-載體復(fù)合物可以選擇性地與蛋白質(zhì)結(jié)合，溶液中的pH值、離子強(qiáng)度及蛋白質(zhì)濃度等條件對(duì)親和結(jié)合的影響力并不大，只有競(jìng)爭(zhēng)性的配基會(huì)降低產(chǎn)物與原配基的親和結(jié)合力，甚至使親和結(jié)合發(fā)生逆轉(zhuǎn)。
      引導(dǎo)產(chǎn)生沉淀的方法有：離子交聯(lián)；加入帶相反電荷的聚合物；加入帶相反電荷的疏水基團(tuán)；改變pH值，誘導(dǎo)產(chǎn)生疏水沉淀；溫度誘導(dǎo)產(chǎn)生沉淀。
      親和結(jié)合：將親和配基加入到含有目的物蛋白質(zhì)的溶液中，調(diào)節(jié)好有關(guān)沉淀的條件，使之有利于親和結(jié)合。
      洗滌：為經(jīng)過(guò)處理的粗制液中發(fā)生親和沉淀可能會(huì)發(fā)生非特異性結(jié)合，尤其是使用帶電的聚合物，離子交換的效應(yīng)將使其他蛋白質(zhì)共同沉淀，因此在分離目的物之前要洗滌沉淀物。其做法是：加入適當(dāng)?shù)那逑磩┲匦氯芙獬恋?，再沉淀；或在專一性洗脫之前?清洗沉淀。在上述過(guò)程中要始終保持目的蛋白質(zhì)與配基處于親和結(jié)合狀態(tài)。
      配基-載體復(fù)合物與目的蛋白質(zhì)的分離：分離結(jié)束之后，要確?；厥漳康牡鞍踪|(zhì)和配基-載體復(fù)合物，目的蛋白質(zhì)要達(dá)到一定的純度，回收率要高。