賽默飛與合作實驗室成功開發(fā)標準化HRMS1-DIA方法

關(guān)注我們，更多干貨和驚喜好禮癌癥Moonshot計劃啟動后，出現(xiàn)了許多精準醫(yī)學(xué)項目，該計劃旨在通過改善早期發(fā)現(xiàn)，患者分類以及監(jiān)測治療效果和復(fù)發(fā)來增強癌癥患者的管理，從而加速癌癥研究。有關(guān)蛋白質(zhì)型的信息，定義為蛋白質(zhì)組的實際狀態(tài)，其數(shù)量，時間和空間的表達以及與基因型的相關(guān)性（所謂的蛋白質(zhì)組學(xué)），將大大增加我們對包括癌癥在內(nèi)的各種人類疾病的理解。在這一過程中，迫切需要一種質(zhì)譜分析策略，以提供可靠且可重現(xiàn)的定量數(shù)據(jù)。

Orbitrap已經(jīng)成為蛋白質(zhì)組學(xué)實驗室的金標準，賽默飛高級產(chǎn)品經(jīng)理軒玥博士聯(lián)合多個實驗室瞄準數(shù)據(jù)非依賴性質(zhì)譜采集（Data-independent acquisition，DIA）的非標記定量蛋白質(zhì)組方法，用于支持精準醫(yī)學(xué)的高通量臨床蛋白質(zhì)組學(xué)分析。作者首先建立了高通量、簡化的HRMS1-DIA工作流程，該工作流程在隨后的11個實驗室中連續(xù)7天測試和集中的數(shù)據(jù)處理；開發(fā)了一種質(zhì)量控制（QC）系統(tǒng)，以監(jiān)視整個工作流程的性能，即時發(fā)現(xiàn)儀器性能的變化，并在必要時指導(dǎo)故障排除，確保維持較高水平的數(shù)據(jù)質(zhì)量，以實現(xiàn)大型臨床隊列研究所需的通量；在整個研究過程中，每個實驗室都使用一套完善的非標記定量樣品對定量性能進行評估，從而可以進行分布式和縱向數(shù)據(jù)分析，并可以在大數(shù)據(jù)分析時進行比較和標準化。

簡化的HRMS1-DIA工作流程進行數(shù)據(jù)采集和分析

?鑒定QC:

PierceTM Hela Protein Digest Standard

?定量QC:

Sample A(20%E.coli,15%Yeast和65%Hela),

Sample B(4%E.coli,30%Yeast和65%Hela)

?色譜條件:

ES806(Acclaim PepMap RSLC C18, 2 µm,100 Å,150 µm i.d. × 150 mm),

60min色譜梯度，流速1.2µL/min

?質(zhì)譜:QEHF

?DIA數(shù)據(jù)采集方法:

HRMS1-DIA，1個cycle包括3個R120K MS1掃描，每個MS1掃描之間穿插18個15 Da 隔離窗口的R30K DIA MS / MS掃描（總共54個DIA MS/MS掃描）。高分辨的一級用于定量分析，二級用于肽段鑒定。此處采用的HRMS1-DIA方法中，MS1掃描周期速率（1.7s）與MS2循環(huán)時間無關(guān)，可確保有足夠數(shù)量MS1掃描的數(shù)量保證定量的重現(xiàn)性。相比之下，MS2采集時設(shè)置相對較窄15Da的隔離窗口，能夠大限度的提高肽檢測效率。

?數(shù)據(jù)分析:

11個實驗室的數(shù)據(jù)統(tǒng)一上傳至Thermo Cloud云平臺，SpectronautTM軟件提取DIA色譜峰。

HRMS1-DIA實驗流程（點擊查看大圖）

鑒定QC質(zhì)控標準

每個實驗室根據(jù)鑒定QC進行系統(tǒng)質(zhì)控，作者提出了多個質(zhì)控的指標，蛋白質(zhì)組學(xué)實驗室可以作為參考，包括色譜的峰寬、MS1和MS2采集的點數(shù)、Precursor和蛋白數(shù)目以及定量的CV。只有符合QC相應(yīng)的指標才能繼續(xù)實驗。如果不滿足條件，需要排查是色譜問題還是質(zhì)譜問題。

定量QC的質(zhì)控

定量QC的目的是考察HRMS1-DIA定量流程的準確性，SampleA/B中Hela的理論比例是1:1，Yeast是1:2，E.coli是4:1。作者提出了兩種方法對定量QC進行質(zhì)控：

（1）定量真實比值與理論比值的偏差，不超過25%；

（2）定量的重現(xiàn)性，CV小于25%。

HRMS1-DIA的重現(xiàn)性

Sample A和Sample B在11個實驗室進行7天的數(shù)據(jù)采集，一共產(chǎn)生了240個DIA數(shù)據(jù)，共鑒定超過7600個蛋白，其中4000個人蛋白，2000個酵母蛋白以及400個E.coli蛋白。首先看單個實驗室7天內(nèi)ding量的重現(xiàn)性，平均每個實驗室每天均可以分別定量超過6500個蛋白；然后看實驗室間的重現(xiàn)性，5784個蛋白被每個實驗室定量到，4564個蛋白被每個實驗室每天定量到。

HRMS1-DIA定量的重現(xiàn)性。（a）每個實驗室平均定量到的蛋白，共定量的蛋白，共同定量到的蛋白數(shù)目和百分比；（b）各個實驗室組合中共同定量的蛋白質(zhì)數(shù)量。（點擊查看大圖）

如何獲取HRMS1-DIA方法？

點擊文末左下角閱讀原文，可查看本實驗HRMS1-DIA全部的方法，包括色譜、質(zhì)譜和數(shù)據(jù)分析方法，有興趣的老師可以查閱。文章中使用的液相色譜、液相色譜柱等備件我們已經(jīng)做成了相應(yīng)的貨號，可以和當(dāng)?shù)劁N售聯(lián)系。

詳細HRMS1-DIA方法

HRMS1-DIA工作流助力精準醫(yī)學(xué)轉(zhuǎn)化研究（上）

HRMS1-DIA工作流助力精準醫(yī)學(xué)轉(zhuǎn)化研究（下）

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