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在這項(xiàng)研究中,我們假設(shè)傳感器系統(tǒng)可用于小膠質(zhì)細(xì)胞代謝的無創(chuàng)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè),以進(jìn)一步闡明動(dòng)態(tài)微環(huán)境下特定表型的極化水平。我們?cè)O(shè)計(jì)并制造了一種微流控芯片,用于在連續(xù)流動(dòng)下培養(yǎng)小膠質(zhì)細(xì)胞,并將氧氣和 pH 值的變化與激活后的極化狀態(tài)相關(guān)聯(lián)。
炎癥是由外來抗原、病原體和化學(xué)物質(zhì)等刺激引發(fā)的一系列復(fù)雜事件。它在多種疾病中發(fā)揮關(guān)鍵作用,例如自身免疫性疾病、癌癥和傷口愈合過程 [1]。巨噬細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞由于其抗原呈遞、吞噬作用和免疫調(diào)節(jié)特性而分別在炎癥和神經(jīng)炎癥中發(fā)揮重要作用 [2]。小膠質(zhì)細(xì)胞作為巨噬細(xì)胞的一種亞型,在神經(jīng)免疫反應(yīng)中也像巨噬細(xì)胞一樣發(fā)揮作用 [3]。根據(jù)它們?cè)谏砦h(huán)境中暴露的信號(hào),小膠質(zhì)細(xì)胞可以轉(zhuǎn)化為兩種不同的表型,稱為 M1 和 M2 [4]。也稱為“經(jīng)典激活”的促炎 M1 小膠質(zhì)細(xì)胞可以由脂多糖 (LPS) 誘導(dǎo),而 IL-4 和 IL-13 誘導(dǎo)“交替激活”抗炎 M2 表型 [5,6]。為了響應(yīng)對(duì) M1 表型的刺激,已顯示巨噬細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞中發(fā)生代謝變化。在 LPS 刺激期間,產(chǎn)生的一氧化氮 (NO) 會(huì)抑制氧化磷酸化,從而導(dǎo)致細(xì)胞轉(zhuǎn)為糖酵解。由于這種反應(yīng),乳酸產(chǎn)量增加,這反過來又增加了細(xì)胞外酸化率 (ECAR)。監(jiān)測(cè) pH 值的變化可以深入了解細(xì)胞和組織的生理和代謝狀態(tài) [7]。小膠質(zhì)細(xì)胞的極化狀態(tài)通常可以通過基因表達(dá)、細(xì)胞表面標(biāo)志物和釋放到培養(yǎng)基中或在細(xì)胞外基質(zhì)中積累的蛋白質(zhì)來檢測(cè)。在這方面PCR、流式細(xì)胞儀、ELISA 和 Western Blotting 是尤為常見的方法之一,它們具有侵入性、費(fèi)力且耗時(shí)。這些技術(shù)也不能提供關(guān)于極化狀態(tài)變化的洞察力和實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。體外 實(shí)驗(yàn)。微流控芯片上的器官系統(tǒng)通過為異質(zhì)細(xì)胞群提供具有動(dòng)態(tài)培養(yǎng)模型的 3D 分層架構(gòu),提供了出色的體外 平臺(tái)來模擬復(fù)雜的器官/組織。先前已經(jīng)報(bào)道了具有復(fù)雜病因的疾病的神經(jīng)炎癥模型,這進(jìn)一步突出了生物工程微環(huán)境的優(yōu)勢(shì)[8]。
材料與方法
微流控芯片由聚二甲基硅氧烷 (PDMS) 制成,因?yàn)樗哂腥犴g性,便于插入傳感器插頭和密封泄漏。為了制造芯片的 PDMS 組件,PDMS 分別用 1:10 的固化劑和 PDMS 混合物澆鑄在聚甲基丙烯酸甲酯 (PMMA) 模具上。在真空下脫氣后,將模具在 80 ºC 下烘烤一小時(shí),然后從模具中切出碎片。芯片 A 是一種混合芯片,包括 PMMA 和 PDMS 組件。芯片的底部包含一個(gè)用于 3D 培養(yǎng)和流體流動(dòng)的通道,在這些層上帶有一個(gè) PDMS 層,帶有入口、出口和傳感器插頭端口。有一個(gè)額外的 PMMA 層包圍了芯片,為光纜提供結(jié)構(gòu)支撐,從而促進(jìn)螺栓的壓縮。所有這些層都在 6 個(gè)螺栓的幫助下結(jié)合在一起(圖 1C)。芯片 B 有兩層。在軟光刻之后,將制造的 PDMS 組件等離子結(jié)合到顯微鏡載玻片上。鍵合后,將這些芯片放置在 120°C 的熱板上 2 小時(shí)以增強(qiáng)鍵合強(qiáng)度。
圖 1:用于 3D 和 2D 小膠質(zhì)細(xì)胞極化的兩種不同制造的微流控芯片的圖像。用于 3D 細(xì)胞培養(yǎng)的芯片 A 的設(shè)計(jì):A) AutoCAD 圖紙,尺寸以 [mm] 為單位,B) 芯片 A 從上到下的層數(shù),C) 帶有藍(lán)色染料和傳感器插頭假人的芯片 A 的圖像,芯片 B 的設(shè)計(jì)用于2D 細(xì)胞培養(yǎng):D) 芯片 B 的尺寸,E) 芯片 B 的層數(shù),F(xiàn)) 帶有紅色染料和傳感器插頭假人的芯片 B 的圖像。 N9小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞系用于巨噬細(xì)胞極化實(shí)驗(yàn)。使用* RPMI(無酚)培養(yǎng)基 1640(補(bǔ)充有 10% 胎牛血清 (FBS) 和 1% 青霉素/鏈霉素 (Pen/Strep))進(jìn)行細(xì)胞擴(kuò)增。將細(xì)胞培養(yǎng)至 80% 融合并用 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 收獲。用高細(xì)胞密度 (4.5 x 10 5細(xì)胞/cm 2 )接種乙醇滅菌的芯片,并在靜態(tài)條件下在 37 °C 和 5% CO 2下孵育過夜。
一旦小膠質(zhì)細(xì)胞粘附并形成單層培養(yǎng)物,就使用注射泵(哈佛儀器)以 0.5 µl/min 的連續(xù)流量進(jìn)行管理(圖 2)。用 300 ng/ml 脂多糖 (LPS) 將小膠質(zhì)細(xì)胞極化為 M1 樣表型 24 小時(shí)。在整個(gè)研究過程中,未刺激的細(xì)胞用作對(duì)照組。將微流控芯片放置在細(xì)胞培養(yǎng)箱中,并將傳感器插頭連接到光纖電纜。收集氧氣和 pH 傳感器測(cè)量值 24 小時(shí)。在數(shù)據(jù)采集過程中,沒有打開培養(yǎng)箱以避免任何氣體和溫度波動(dòng)。
圖 2:實(shí)驗(yàn)裝置:A) 連接到光纖儀表和計(jì)算機(jī)的傳感器圖像,B) 注射泵和芯片的圖像,C) 培養(yǎng)箱內(nèi)的芯片和連接的光纜。
圖 2:實(shí)驗(yàn)裝置:A) 連接到光纖儀表和計(jì)算機(jī)的傳感器圖像,B) 注射泵和芯片的圖像,C) 培養(yǎng)箱內(nèi)的芯片和連接的光纜。
在微流控芯片中動(dòng)態(tài)培養(yǎng) 24 小時(shí)后,將含有 15 µM 二硫蘇糖醇 (DTT) 的裂解緩沖液移液到通道中以裂解細(xì)胞。收集裂解物并儲(chǔ)存在-80°C 用于 RNA 分離。使用 Macherey-Nagel RNA 分離試劑盒分離 RNA。通過 qPCR 分析根據(jù)其 TNFα、IL-6 和 iNOS 基因表達(dá)水平比較對(duì)照組和 M1 組。
在 24 小時(shí)孵育期間從微流控芯片出口收集的上清液用于 ELISA。Affymetrix eBioscience 小鼠 TNFα 試劑盒已根據(jù)制造商說明使用。為了驗(yàn)證我們的傳感器讀數(shù)并確認(rèn) M1 極化,我們確定了對(duì)照組和 M1 組釋放的 TNFα 水平。
結(jié)果
溶解氧顯示 LPS 刺激的小膠質(zhì)細(xì)胞和未刺激的對(duì)照組減少。雖然在兩種情況下都有類似的趨勢(shì),但在 24 小時(shí)的刺激期間,M1 極化小膠質(zhì)細(xì)胞的氧水平低于對(duì)照。對(duì)于 LPS 刺激的細(xì)胞,對(duì)照的溶解氧水平降低了 22.2% 和 29.5%(圖 3A)。在 pH 監(jiān)測(cè)芯片中,pH 水平在 24 小時(shí)內(nèi)下降,其中對(duì)照的最終值為 6.8,LPS 刺激細(xì)胞的最終值為 6.5。
圖 3:24小時(shí)刺激期間O 2和 pH 曲線的傳感器數(shù)據(jù)。A) 對(duì)照和 LPS 刺激細(xì)胞的 O 2 % 變化,B) 對(duì)照和 LPS 刺激細(xì)胞的 pH 變化。
在 24 小時(shí)結(jié)束時(shí)對(duì) TNFα、IL-6 和 iNOS 的基因表達(dá)分析顯示了顯著的倍數(shù)變化,證實(shí)了動(dòng)態(tài)微流體培養(yǎng)下 LPS 刺激的小膠質(zhì)細(xì)胞的 M1 極化。ELISA 測(cè)定表明從 LPS 刺激的細(xì)胞 (M1) 釋放的 TNFα 細(xì)胞因子顯著增加。在動(dòng)態(tài)條件下 24 小時(shí)后的 TNFα 濃度測(cè)量為未刺激的對(duì)照為 102 pg/ml,LPS 刺激的小膠質(zhì)細(xì)胞為 470 pg/ml。
圖 4:對(duì)照和 LPS 刺激細(xì)胞的 mRNA 表達(dá)。A) 對(duì)照和 LPS 刺激細(xì)胞的 TNFα mRNA 表達(dá),B) 對(duì)照和 LPS 刺激細(xì)胞的 IL-6 mRNA 表達(dá),C) 對(duì)照和 LPS 刺激細(xì)胞的 iNOS mRNA 表達(dá)。*P≤0.05,**P≤0.01,***P≤0.001。P 值是從雙尾學(xué)生 t 檢驗(yàn)計(jì)算的。
圖 5:從對(duì)照和 LPS 刺激的芯片出口收集的培養(yǎng)基的 TNFα 濃度水平 (pg/ml)。*P≤0.05,**P≤0.01,***P≤0.001。P 值是從雙尾學(xué)生 t 檢驗(yàn)計(jì)算的。
討論
本研究的最初目的是觀察 3D 培養(yǎng)中極化過程中小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生的代謝變化。為此,我們?cè)O(shè)計(jì)并制造了用于 3D 動(dòng)態(tài)培養(yǎng)的芯片 A,并刺激細(xì)胞向 M1 表型發(fā)展。我們觀察到,與 2D 培養(yǎng)相比,3D 培養(yǎng)中的細(xì)胞沒有有效極化。我們得出結(jié)論,成功極化的細(xì)胞數(shù)量較少可能不足以改變整體代謝測(cè)量。為了證明新型傳感系統(tǒng)在微流體研究中的優(yōu)勢(shì),我們專注于更傳統(tǒng)的二維培養(yǎng),并與文獻(xiàn)討論了結(jié)果。因此,我們決定在微流控芯片內(nèi)進(jìn)行二維動(dòng)態(tài)單層培養(yǎng)。這些結(jié)果也促使我們將微流控芯片 A 改為芯片 B。經(jīng)過 24 小時(shí)的刺激,我們通過 qPCR 分析確保 M1 極化的成功。典型 M1 狀態(tài)標(biāo)志物 TNFα、IL-6 和 iNOS 的 mRNA 表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組。接下來,我們展示了受刺激的細(xì)胞實(shí)際上完成了從 mRNA 到蛋白質(zhì)水平的翻譯過程。為此,我們通過執(zhí)行 ELISA 測(cè)定了微流控芯片出口處分泌的 TNFα 蛋白的水平。
pH 變化與文獻(xiàn)一致:在之前的幾項(xiàng)研究中,M1 極化已被證明會(huì)導(dǎo)致 pH 水平降低,因?yàn)槭艽碳さ募?xì)胞具有更高的 ECAR。在我們的研究中,與對(duì)照芯片相比,我們能夠觀察到 LPS 刺激芯片內(nèi)的 pH 值要低得多。但是當(dāng)我們查看芯片的初始 pH 值時(shí),它們是不同的。這可能是由于微通道內(nèi)的氣泡形成。氣泡會(huì)影響芯片介質(zhì)內(nèi)的溶解氣體濃度,而溶解氣體會(huì)改變介質(zhì)的 pH 值。CO 2通過降低 pH 值來影響介質(zhì),另一方面,如果介質(zhì)暴露于富含氧氣的氣體中,則介質(zhì)的 pH 值會(huì)增加。如果對(duì)照介質(zhì)暴露于 O 2豐富的氣泡,這可以解釋較高的 pH 值。這種差異還有另一種可能性。設(shè)置實(shí)驗(yàn)和開始測(cè)量大約需要 40 分鐘。在測(cè)量開始之前將細(xì)胞暴露于刺激因子。這可能是由于 LPS 刺激的細(xì)胞在刺激后通過 iNOS 的形成降低了培養(yǎng)基的 pH 值[7]。
O 2水平與文獻(xiàn)不符:N9 小膠質(zhì)細(xì)胞的 LPS 刺激降低了增殖率并改變了細(xì)胞代謝,使其成為糖酵解依賴性。細(xì)胞代謝的這些變化導(dǎo)致耗氧量降低,并且由于細(xì)胞周期停滯 [9] 與相對(duì)較低的細(xì)胞數(shù)量相結(jié)合,LPS 刺激細(xì)胞的溶解氧水平測(cè)量值預(yù)計(jì)將高于對(duì)照,并且必須具有增加的趨勢(shì)24小時(shí)刺激。我們的結(jié)果顯示 LPS 刺激細(xì)胞的氧水平降低了 7%。必須進(jìn)行更多的實(shí)驗(yàn)以更好地理解為什么會(huì)出現(xiàn)這種與文獻(xiàn)的分歧。
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