適配子(Aptamer)是對某個靶點分子有特異結合的DNA或RNA寡核苷酸，因其特殊的分子識別能力在診斷和治療應用中具有巨大的潛力。然而，高親和力和高特異性的核酸適配子往往不容易獲得。適配子一般是通過SELEX方法從核酸庫中進行篩選，這個方法依賴于將靶點分子固定在某個固相，再去釣取潛在與靶點結合的適配子，但是固化有可能導致的空間位阻限制了靶點和適配子結合的自由度。
背景與實驗設計
近期的一篇文章中，四川大學生命科學學院黃震組先將靶點生物素化，然后將生物素靶點(HPV L1蛋白)和適配子在液相中混合形成適配子-靶點復合物，再用偶聯(lián)鏈霉親和素的固相介質(包括磁珠和Octet® 傳感器)去抓取這種復合物，并進行洗脫鑒定，這樣便成功克服了先固化靶點所帶來的不利影響，使得適配體的篩選效率顯著提升，該方法被稱之為 Free Aptamer-ligand Interaction (FRARI)[1]。
圖1. FRARI示意圖：通過多輪FRARI循環(huán)，富集和篩選到高親和力的適配子
本篇文章在篩選適配子過程中做了2個不同維度的比較：
1 SELEX, Octet® (BLI法，生物層干涉), 和MB (磁珠法)三種方法的比較；
2 隨機生物素化靶點和定點生物素化靶點的比較：前者通過靶點蛋白的氨基隨機共價偶聯(lián)生物素，后者通過Avi tag在N端進行定點生物素化，原則上后者可以更好地保持靶點的天然結構。
Octet® 的實驗方法與結果
將生物素化靶點和DNA文庫室溫下孵育1小時。然后，使用Octet® 的SA傳感器與混合物孵育50分鐘來捕獲形成的復合物。用PBS洗滌兩次(一次600秒，一次120秒)后，將捕獲的復合物傳感器用蛋白酶K(1.8μL，20mg/mL)52°C中消化2小時。接下來，擴增、制備次輪文庫，進行多輪篩選后測序鑒定。
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| 圖2. SELEX, MB, Octet® 三種方法比較(定點生物素化法)：SELEX 九輪富集的特異適配子豐度(a)遠遠低于FRARI方法，包括BLI(b)和MB(c) |
對比發(fā)現(xiàn)，Octet® 法和MB法在進行6輪篩選后便能富集獲得特異性適配子，而在經過9輪篩選后，Octet® 法和MB法均實現(xiàn)了高豐度的特異性適配子富集。并且基于FRARI的Octet® 法篩選出的幾個高親和力適配子與基于MB法篩選的結果是一致的。更關鍵的是，Octet® 法豐度的區(qū)分度更好，比如最高豐度的一個適配子(藍色)占絕大多數(shù)，隨后的實驗也證實該適配子具有更強的親和力，說明Octet® 可以更好地區(qū)分特異性適配子的親和力。
方法驗證
Octet® 篩選出的豐度好的適配子(S4)親和力是否強呢？作者將生物素化的適配子固化在鏈霉親和素(SA)傳感器上，與靶點蛋白進行結合解離，以計算結合動力學參數(shù)。
圖3. Octet® 法篩選出的適配子與靶點親和力，可見S4的親和力最高，KD值達到幾十nM
隨后作者使用Octet® 法篩選的適配子成功建立了基于夾心法的HPV臨床診斷方法，實現(xiàn)了臨床樣品中HPV的檢測，進一步證明這些適配子的強親和力和特異性。
Octet® 傳感器不僅適合FRARI法，而且相對MB法，Octet® 可以排除許多低親和力適配子，這可能是因為BLI傳感器具有較少的表面積和非特異性結合。因此，Octet® 為核酸適配體的選擇提供了高效率的篩選方法。
最近廣西大學發(fā)表的一篇文章中，開發(fā)了一種便攜式、獨立的核酸適配子傳感器用于檢測蝗蟲信息素4-乙烯基苯甲醚(4VA)，以監(jiān)測蝗蟲種群動態(tài)，實現(xiàn)蝗災預警。使用Octet® 的垂釣方法獲得了針對4VA的KD值為269.25±90.65nM的高親和力適配子，并用此來建立傳感器檢測方法。
圖4. 使用Octet® 傳感器固化4-乙烯基苯甲醚(4VA)，結合適配子庫，然后用不同強度方法洗脫與4VA結合的適配子
表1. Octet® 篩選的適配子用Octet®進行親和力測定
Octet® 不僅可以用于垂釣，也可以用于親和力的驗證哦！
Octet® 用于親和力驗證的優(yōu)點在于：
• 非標記Direct Binding是趨勢，不需要標記和信號放大，可以更好地保持反應物的活性
• 快速測定親和力，提供結合速率常數(shù)和解離速率常數(shù)更加定量化地表征分子互作
• 無洗滌步驟，可測弱親和力(解離快)
• 寫入了美國藥典，文章多，認可度廣
• 萬金油技術，可以用與檢測DNA，小分子，蛋白質等各種生物分子
• 操作簡便，耗材及維護成本低
大家大膽地使用垂釣神器 Octet® 非標記分子互作系統(tǒng)去發(fā)現(xiàn)未知世界吧！
-參考文獻-
【1】Highly-efficient selection of aptamers for detecting various HPV subtypes in clinical samples.Talanta 2023. https://doi.org/10.1016/j.talanta.2023.125039
【2】Development of functional nucleic acid sensor for detection of locust pheromone 4-vinylanisole.Chemical Engineering Journal 466 (2023) 143065
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