分子垂釣是生命科學(xué)研究中的一種常用技術(shù)，其基本原理就是從一個(gè)分子庫(例如某個(gè)細(xì)胞裂解液)釣取可以與配體結(jié)合的受體分子。通常情況下，我們先將配體固定在固相中，然后讓其與細(xì)胞裂解液中的分子進(jìn)行結(jié)合，最后將結(jié)合的受體洗脫并交由質(zhì)譜(MS)進(jìn)行鑒定。
基于生物層干涉技術(shù)(BLI)的Octet® 非標(biāo)記分子互作系統(tǒng)能夠快速、全自動(dòng)、多通道平行地測試濃度和動(dòng)力學(xué)常數(shù)。Octet® 的光纖生物傳感器可以通過多種方法固化配體，這不僅可以提供減少非特異性的良好固相，而且可以與質(zhì)譜(MS)進(jìn)行搭配使用，形成BLI-MS聯(lián)用技術(shù)。
圖1. BLI-MS的實(shí)驗(yàn)流程如下：
• 將生物傳感器浸入緩沖液中進(jìn)行平衡
• 將配體(例如抗體)固定到傳感器上
• 在用分析物基質(zhì)平衡后，將加載配體的生物傳感器浸入分析物溶液中進(jìn)行結(jié)合
• 經(jīng)過短暫洗滌后，將捕獲的分析物在低pH溶液中洗脫
• 重復(fù)進(jìn)行結(jié)合和洗脫步驟，在同一孔洗脫液洗脫并富集受體
• 通過LC-MS/MS消化和分析蛋白質(zhì)，從而鑒定分析物
BLI-MS技術(shù)的可行性需要解答以下幾個(gè)問題：
Q
• 需要多少量的目標(biāo)蛋白才能進(jìn)行有效的垂釣？
• 釣出的背景蛋白數(shù)量是多少？
• 是否可以觀察到垂釣步驟的BLI信號(hào)？
• 如果一次垂釣洗脫量不足，需要重復(fù)垂釣幾次？
• 這個(gè)過程的成本是多少？操作是否復(fù)雜？
接下來，我們就根據(jù)一篇相關(guān)文章[1]，和大家一起探討B(tài)LI做垂釣的可行性。
圖2. 垂釣方法開發(fā)思路：先從純蛋白垂釣鑒定蛋白量下限，再檢測高豐度和低豐度蛋白垂釣可行性
BLI-MS可捕獲和鑒定重組GFP
將GFP抗體固化在鏈霉親和素(SA)傳感器上，并讓其與純的GFP進(jìn)行結(jié)合。通過LC-MS/MS方法對(duì)洗脫液進(jìn)行鑒定，可以確認(rèn)GFP已被成功捕獲并從生物傳感器中洗脫出來。GFP的MS信號(hào)強(qiáng)度與所用GFP的濃度成比例增加，檢測閾值為0.63 nM，這意味著僅需3.38 ng的GFP就可以被垂釣和鑒定出來。這個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證了Octet® 進(jìn)行垂釣的可行性。
圖3. 左上圖：LC-MS /MS分析后，各濃度生物傳感器洗脫液中的GFP蛋白MS1強(qiáng)度；
右上圖：對(duì)數(shù)MS信號(hào)強(qiáng)度和濃度曲線圖；
下圖：使用Skyline提取的一種GFP肽(FEGDTLVNR)的離子色譜提取(XIC)信號(hào)
BLI-MS可以捕獲和鑒定細(xì)胞裂解物中帶有GFP標(biāo)簽的蛋白質(zhì)
為了在復(fù)雜的生物樣品中測試BLI-MS方案，該研究使用Octet® 從表達(dá)融合蛋白胱氨酸素-GFP的小鼠成纖維細(xì)胞的細(xì)胞裂解物中垂釣GFP標(biāo)記的蛋白質(zhì)。使用固化GFP抗體的傳感器，垂釣總蛋白100 μg、10 μg和 1 μg的裂解物，分別用30 個(gè)和 10 個(gè)結(jié)合/洗脫循環(huán)。文章設(shè)置了兩個(gè)陰性對(duì)照：
i 固化非相關(guān) IgG 的生物傳感器，從表達(dá)融合蛋白的細(xì)胞中捕獲細(xì)胞裂解物
ii 使用裝載有GFP抗體的生物傳感器，從轉(zhuǎn)染EV(Empty Vector)的細(xì)胞中捕獲細(xì)胞裂解物(不含GFP)
在 100 μg ，10 μg裂解物的 BLI-MS 實(shí)驗(yàn)中，我們觀察到了明顯的GFP融合蛋白的BLI信號(hào)，而兩個(gè)陰性對(duì)照沒有，這說明有GFP蛋白已被成功垂釣出來。經(jīng)過LC-MS/MS分析，我們在所有陽性樣品中都檢測到GFP，而兩個(gè)陰性對(duì)照則沒有，這進(jìn)一步說明了Octet® 做為一種垂釣方法的良好特異性。隨著循環(huán)數(shù)的增加和總蛋白量的增多，GFP信號(hào)增強(qiáng)，但同時(shí)背景蛋白數(shù)量也會(huì)增多。綜合考慮，可以選擇300 μg總蛋白量和10個(gè)循環(huán)的富集(耗費(fèi)約1個(gè)小時(shí))。
圖4. 使用Octet®從總細(xì)胞裂解物中分離GFP融合蛋白結(jié)果
Octet®傳感圖顯示：含有總蛋白100 μg(A)、10 μg(B)和1μg(C)成纖維細(xì)胞裂解物中，實(shí)時(shí)鑒定垂釣GFP 融合蛋白的情況
直方圖顯示：在進(jìn)行1個(gè)和30個(gè)循環(huán)(D、E、F)后，對(duì)洗脫液進(jìn)行LC-MS/MS分析后GFP的MS1強(qiáng)度
堆積面積圖顯示：100 個(gè)和 10 個(gè)循環(huán)后從總蛋白1 μg(G)、30 μg(H)和 10 μg(I) 成纖維細(xì)胞裂解物中鑒定出的背景蛋白數(shù)量
BLI-MS可從脾細(xì)胞裂解物中捕獲和鑒定內(nèi)源性CD16a
為了測試BLI-MS在復(fù)雜生物樣品中捕獲和鑒定內(nèi)源性蛋白質(zhì)性能，研究嘗試從300 μg人脾細(xì)胞裂解物中垂釣CD16a。陰性對(duì)照是固化無關(guān) IgG 的生物傳感器。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。
在三次實(shí)驗(yàn)中，CD16a抗體包被的生物傳感器上均有明顯的BLI信號(hào)，說明有物質(zhì)被釣出。經(jīng)過LC-MS/MS分析，可以在陽性樣品中檢測到CD16a，而三份陰性樣品中未檢測到CD16a。相對(duì)于高豐度樣品，雖然組織裂解物的蛋白背景更多，但是扣除陰性對(duì)照的蛋白后，陽性樣品可以鑒定出10種特異結(jié)合的蛋白質(zhì)，其中CD16a豐度最高，進(jìn)一步說明了Octet® 用于垂釣的高度特異性。
圖5. 兩份陽性樣品的BLI結(jié)合圖：紅色為對(duì)照(固化無關(guān)IgG對(duì)照)，綠色為陽性樣品(固化CD16抗體)
表1. 列出了固化CD16a抗體的生物傳感器樣品中專門鑒定的 10 種蛋白質(zhì)(含每個(gè)樣品的肽、總強(qiáng)度和種質(zhì)名稱)
通過本文的實(shí)驗(yàn)，我們得出Octet® 做分子垂釣的如下結(jié)論：
• 對(duì)于高豐度和強(qiáng)結(jié)合受體，只需3-5個(gè)循環(huán)，且上樣蛋白總量可以較低
• 豐度低內(nèi)源性蛋白垂釣也沒問題，總蛋白量和循環(huán)數(shù)需要多一點(diǎn),比如300 μg和30個(gè)循環(huán)
• 時(shí)間為1-3小時(shí)(10-30循環(huán))，并且可以全自動(dòng)化進(jìn)行
• 通常只需一根陰性對(duì)照傳感器和一根樣品垂釣傳感器，耗材成本低于200元
與傳統(tǒng)方法相比，使用Octet®進(jìn)行垂釣的優(yōu)勢在于：
• 提供多種傳感器固化已知分子，并且盡可能減少非特異性吸附
• 通過垂釣的BLI信號(hào)，可以判斷是否有物質(zhì)釣出
• 可以自動(dòng)化多次循環(huán)，在同一個(gè)孔里富集洗脫樣品
• 將垂釣后的物質(zhì)可以進(jìn)行純化，由于采用非標(biāo)記實(shí)時(shí)技術(shù)，可以更可信的測定受體與配體的親和力
小伙伴們，立即利用你們手中的Octet® 的垂釣功能去發(fā)現(xiàn)新大陸吧！
-參考文獻(xiàn)-
[1] BLI-MS: Combining biolayer interferometry and massspectrometry. Proteomics 2022, 22:2100031
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