慢病毒載體(Lentivirus vector, LV)是逆轉(zhuǎn)錄病毒科的一種包膜病毒,能夠穩(wěn)定整合在分裂和非分裂細(xì)胞中表達(dá)的轉(zhuǎn)基因,且包裝容量大、細(xì)胞毒性和免疫原性低、感染譜廣、可實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定表達(dá)等優(yōu)勢(shì),是當(dāng)前基因治療和細(xì)胞療法廣泛使用的病毒載體之一。
慢病毒載體是一種有包膜的RNA病毒,直徑為80-120nm,呈二十面體對(duì)稱結(jié)構(gòu)、球形,包裝容量一般為4.5~5kb;慢病毒的活性容易受生產(chǎn)工藝中的壓力,剪切力,溫度,鹽濃度,pH等影響。
下面從幾個(gè)核心步驟來(lái)介紹下慢病毒下游工藝開發(fā)策略:
慢病毒載體下游分離純化工藝基本上采用層析分離技術(shù)和中空纖維膜兩大技術(shù)。一般病毒載體純化層析會(huì)用到分子篩,復(fù)合模式和離子交換層析等多種層析方式;中空纖維技術(shù)包括澄清過(guò)濾,切向流過(guò)濾兩方面。
慢病毒純化基本流程及核心工藝步驟優(yōu)化點(diǎn)如下:
01 澄清收獲
澄清過(guò)濾主要是去除介質(zhì)中的細(xì)胞和細(xì)胞碎片及部分的HCD,HCP,并降低粘度。常用的方法為深層過(guò)濾,離心,死端過(guò)濾,或者其中兩種方法結(jié)合為主,但對(duì)于50L以上規(guī)模的慢病毒載體的澄清傾向于深層過(guò)濾或0.2~0.5μm中空纖維。
02 超濾濃縮1
對(duì)澄清過(guò)濾溶液使用300~750KDa的中空纖維柱對(duì)慢病毒載體溶液濃縮換液,可以去除一部分的蛋白,DNA片段等雜質(zhì)分子。濃縮過(guò)程中一般控制剪切力為2000~4000/s-1,TMP為3~7psi,通量>50LMH,濃縮5-10倍
03 核酸酶孵育
加入Benzonase核酸酶,降低DNA分子大小及粘度。核酸酶孵育一般溫度在在25~37℃,處理時(shí)間30~60 min;或溫度控制在2~8℃,過(guò)夜處理,核酸酶濃度在20-50 U/mL,Mg2+離子濃度在1?10 mM
04 層析純化
層析純化在慢病毒載體中占有重要地位,一般選擇MaXtar Q和兩步層析結(jié)合的方式,去除HCP,DNA片段及質(zhì)粒殘留等雜質(zhì);MaXtar COLL 700(分子篩或多模式層析)層析對(duì)小于700KD的HCP,HCD及其他雜質(zhì)成分進(jìn)入層析介質(zhì)基球的內(nèi)孔,通過(guò)離子相互作用疏水左右被保留,而大于700KD的慢病毒不進(jìn)入內(nèi)孔流穿,從而實(shí)現(xiàn)分離;MaXtar Q以離子相互,與慢病毒載體結(jié)合,保留在MaXtar Q層析柱上,通過(guò)鹽梯度,去除工藝雜質(zhì),收獲高活性的慢病毒載體。
由于慢病毒載體受壓力,剪切力,溫度,鹽濃度,pH等因素的影響易聚集,易失活,純化工藝中的一般工藝參數(shù),在15~25℃溫度下層析條件優(yōu)化:MaXtar COLL 700/400 載量: 3~15CV,流速:150~300cm/h;MaXtar Q 載量:5~50CV,洗脫鹽濃度:0.5~0.8M NaCl,洗脫液要及時(shí)稀釋降低鹽濃度。
百林科的MaXtar COLL 700在慢病毒純化使用中的案例分享:
Case1:COLL 700 在慢病毒上的應(yīng)用案例
Case2:COLL 700在慢病毒上的應(yīng)用
結(jié)論:回收率和雜質(zhì)去除效果均達(dá)到去除的預(yù)期。
05 超濾濃縮 2
對(duì)澄清過(guò)濾溶液使用300~750KDa的中空纖維柱對(duì)慢病毒載體溶液濃縮換液。濃縮過(guò)程中一般控制剪切力為2000~4000/s-1,TMP為3~7psi,濃縮慢病毒載體至合適的滴度和換液至制劑需要的緩沖液。
對(duì)于不同慢病毒載體可以選擇以下百林科的產(chǎn)品進(jìn)行純化分離:
以上幾款百林科層析介質(zhì)產(chǎn)品特點(diǎn)可匯總?cè)缦卤恚?nbsp;
掃描二維碼,
百林科多款填料
均可試用!
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