聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR) 是分子生物學(xué)領(lǐng)域功能強(qiáng)大的技術(shù)之一。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 是在標(biāo)準(zhǔn) PCR 技術(shù)基礎(chǔ)上演變而成，常用于定量樣本中的 DNA 或RNA。利用熒光探針或熒光 DNA 結(jié)合染料，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀檢測熒光并完成 PCR 反應(yīng)所需的熱循環(huán)，實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物的定量。實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 分析的部分實(shí)施需要經(jīng)過優(yōu)化以確保所有反應(yīng)參數(shù)均設(shè)置精確，從而獲得準(zhǔn)確的結(jié)果。

1、引物和探針的儲(chǔ)存

盡管引物和探針的儲(chǔ)存經(jīng)常被忽略，但其在保證實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 分析的長期成功和一致性方面具有重要作用。影響引物和探針的穩(wěn)定性的主要因素是儲(chǔ)存溫度、儲(chǔ)存時(shí)間、是否被長時(shí)間暴光、儲(chǔ)存的引物和探針的濃度以及儲(chǔ)存溶液的組分。圖3擴(kuò)增曲線分別顯示了儲(chǔ)存不當(dāng)?shù)囊?(A) 與儲(chǔ)存適當(dāng)?shù)囊?(B) 產(chǎn)生的效果。

2、長期保持引物和探針的穩(wěn)定性保持引物和探針的穩(wěn)定性的關(guān)鍵有四點(diǎn)：

（1）低壓凍干的引物在儲(chǔ)存時(shí)間和溫度方面具有更好的靈活性。引物一旦重新溶解，即應(yīng)置于 -20°C 保存，且若保存時(shí)間超過一年則應(yīng)對(duì)其進(jìn)行監(jiān)測，看它是否出現(xiàn)功能下降。

（2）對(duì)于標(biāo)記的引物和探針，則應(yīng)采取措施避免標(biāo)記物暴光 (例如使用不透明管及置于暗處保存)，以延長它們的使用壽命。

（3）引物濃度也可影響其穩(wěn)定性。建議引物的儲(chǔ)存濃度不低于10 μM；實(shí)際上，在大多數(shù)情況下，100 μM 的引物濃度操作更簡單。引物和探針還應(yīng)分裝保存，以減少凍融次數(shù)，特別是標(biāo)記的引物和探針。

（4）最后，TE 緩沖液可形成比水更為穩(wěn)定的環(huán)境。此外，含有 0.1 mM EDTA的 TE 緩沖液 (標(biāo)準(zhǔn) TE 中含有 1 mM EDTA) 是一種理想的溶液，這是由于一些 PCR 反應(yīng)對(duì) EDTA 的靈敏度可能有一些殘存。