引言

以人類或動物細胞、組織及體液等生物材料為起始原料生產(chǎn)的生物制品，在其制備流程及制劑階段，可能會引入人或動物源的原材料及輔助物質(zhì)。這些起始原料、添加的原材料以及所使用的輔料，均存在遭受病毒污染的潛在威脅。

為了有效控制生物制品受病毒污染的風險，國內(nèi)外監(jiān)管機構(gòu)均出臺相關(guān)法規(guī)，強制要求生物制品的生產(chǎn)流程必須包含能夠有效滅活或去除病毒的工藝步驟，以此來確保最終產(chǎn)品的生物安全性。

病毒污染是構(gòu)成治療用生物制品安全性的重大威脅之一。過去，由于缺乏對病毒污染風險的充分認知，加之病毒檢測技術(shù)與病毒滅活/去除手段存在局限性，血源性生物制品以及通過工程細胞與工程細菌表達生產(chǎn)的生物制品在生產(chǎn)流程中曾遭遇嚴重病毒污染事件。Table 1列舉了部分生物制品遭受病毒污染的典型案例。

隨著對生物制品病毒安全控制要求的不斷提升，基于各國藥品監(jiān)管機構(gòu)與業(yè)界長期積累的豐富經(jīng)驗，一系列針對生物制品病毒安全控制與評估的法規(guī)和技術(shù)規(guī)范相繼出臺。以下是本文在撰寫過程中主要參考的相關(guān)法規(guī)：

病毒安全性評價范圍

生物制品的上游污染來源分為內(nèi)源性和外源性病毒污染兩類。內(nèi)源性病毒污染源包括工程細胞。工程細胞可能源于人的組織或器官、動物的組織或器官、植物的組織或其他來源。這些工程細胞一旦污染病毒，可能會帶入到下游工藝，成為病毒污染的源頭。對于外源性污染源，主要包括物流控制、人員控制、設(shè)施環(huán)境和過程監(jiān)測。

以工程細胞來源生物制品為例，確保細胞庫無污染是生物制品生產(chǎn)的重中之重。監(jiān)管機構(gòu)對細胞庫的污染檢測有明確嚴格的要求。細胞庫鑒定要求人和哺乳動物細胞系從主細胞庫（MCB）、工作細胞庫（WCB）到生產(chǎn)終末細胞（EOPC/CAL）的全面的細胞庫檢定。對于未處理收獲液批次放行，要求每個生產(chǎn)批次收獲的細胞/未經(jīng)處理的細胞收獲液（UPB）均需進行外源病毒和支原體的檢測。其他來源生物制品的病毒污染來源分析和風險控制可以此為參考。

病毒清除定義及實施時間

在GLP實驗室環(huán)境中，通過應(yīng)用縮小模型，有目的的將一定量的模型病毒添加（即“加標”）至未加工的收獲液或各生產(chǎn)步驟的中間體中。這一做法旨在定量評估滅活/去除病毒工藝步驟的有效性，具體通過測量病毒在工藝過程中的下降水平來實現(xiàn)，并據(jù)此確定工藝所能降低的病毒總體水平，以確保產(chǎn)品的安全性。

病毒滅活/去除工藝是保障生物藥品安全性的核心環(huán)節(jié)。根據(jù)監(jiān)管機構(gòu)的嚴格規(guī)定，生物制品的生產(chǎn)流程必須包含能有效滅活/去除病毒的工藝步驟。在提交IND/BLA申請時，必須提供詳盡的病毒清除研究報告。而在產(chǎn)品上市之后，根據(jù)實際需求或生產(chǎn)工藝的任何變更，還需對工藝步驟的有效性進行再次驗證（Fig.1）。

Fig.1 病毒清除驗證時間

指導原則中明確規(guī)定，一個典型的驗證研究所選病毒應(yīng)全面覆蓋多種類型。具體要求包括：至少應(yīng)包含單鏈和雙鏈的RNA及DNA病毒、脂包膜和非脂包膜病毒、強弱抵抗力病毒以及大小顆粒病毒。

Table 2、Table 3、Table 4分別列出了CHO表達生物制品、桿狀病毒/SF9表達系及血液制品中常用的模型病毒及主要特性。

Table 2. CHO表達系中可選用的模型病毒

Table 3. 桿狀病毒/SF9表達系中可選用的模型病毒

Table 4. 血液制品中可選用的模型病毒

病毒清除工藝的有效性評估

法規(guī)中關(guān)于病毒滅活/去除有效性評估的內(nèi)容明確指出了一系列標準，用以衡量工藝步驟的病毒清除效果。

具體而言，若驗證研究中的工藝步驟能夠使指示病毒數(shù)量被去除/滅活達到4個LRV（Log Reduction Value，對數(shù)減少值）或以上，則該步驟的病毒滅活/去除效果被視為有效。對于去除/滅活效果在1至4個LRV之間的工藝步驟，其病毒滅活/去除效果被認定為一般有效。然而，當工藝步驟的去除/滅活效果小于1個LRV時，其病毒滅活/去除效果則被視為不顯著。值得注意的是，這些不顯著的工藝步驟在評估總體工藝病毒滅活/去除效果時，其LRV數(shù)值將不計入總體工藝的病毒滅活/去除LRV總數(shù)之中，否則可能會對清除病毒的實際能力估計過高。這些規(guī)定為病毒滅活/去除工藝的有效性和可靠性提供了明確的評估標準。

在病毒清除工藝的選擇與具體設(shè)計方面，我們需遵循一系列嚴格的原則和要求。首先，選擇工藝時需確保至少包含一步有效的非包膜病毒清除步驟，這是保障病毒清除效果的基礎(chǔ)。同時，工藝中還需至少包含兩種從機制上能互補且有效的工藝步驟，以增強病毒清除的全面性和可靠性。

在具體設(shè)計工藝方案時，我們需進一步細化各項要求。首先，雙申報去除/滅活病毒的驗證研究必須符合GLP（Good Laboratory Practice，良好實驗室規(guī)范）的要求，以確保研究的科學性和嚴謹性。其次，我們需要研究影響去除/滅活病毒效果的各項參數(shù)，包括機械參數(shù)和理化參數(shù)，并確定這些參數(shù)允許變化的幅度，通常通過驗證最劣條件來確保工藝的穩(wěn)定性和適應(yīng)性。

此外，病毒滅活動力學的研究包括病毒滅活速率和滅活曲線的分析，有助于我們更深入地了解病毒滅活的動態(tài)過程。同時，為了更準確地評估病毒清除效果，指示病毒的滴度應(yīng)盡可能高，以模擬最壞情況下的病毒負載。最后，在加入病毒進行驗證時，病毒與待驗證樣品的體積比需控制在一定范圍內(nèi)，一般不超過1∶9，以避免因病毒濃度過高或過低而影響驗證結(jié)果的準確性。

Table 5. 病毒滅活/去除工藝

采用80℃加熱72h的處理方法可以滅活HBV、HCV、HIV和HAV等病毒。應(yīng)該考慮制品的水分含量、制品組成（如：蛋白質(zhì)、糖、鹽和氨基酸）對病毒滅活效果的影響，應(yīng)確定允許的制品瓶間各參數(shù)的差異，同時病毒滅活用的干熱箱至少每半年驗證一次。干熱法適用于凍干制劑、凝血因子制品。

利用有機溶劑和非離子表面活性劑的混合物能夠破壞脂包膜病毒的類脂膜。通常選擇磷酸三丁脂 (TNBP) 和非離子化的去污劑（Triton X-100或PS80）組合。S/D法主要用于凝血因子制品、蛋白酶抑制劑、人免疫球蛋白等血液制品的脂包膜病毒滅活。因為S/D法引入有機溶劑，所以需要在后續(xù)工藝中去除加入的S/D試劑。

如Fig.2所示，使用mAb1和mAb2收獲的細胞培養(yǎng)液(HCCF)進行實驗，以評估溫度和Triton X-100濃度對MuLV滅活的影響。對于這兩種單抗，在12℃時的滅活速度比20℃慢，這表明較低的溫度和較短的時間是最差的情況，A和B圖對比表明0.3%和0.5%Triton X-100對MuLV的滅活效果無差異。

Fig.2 Genentech研究溫度(A)、時間(B) 和Triton X-100濃度對X-MuLV滅活的影響

低pH滅活法針對包膜病毒而且要求樣品在低pH條件下性質(zhì)穩(wěn)定。低pH滅活法是重組或者雜交的動物真核細胞經(jīng)培養(yǎng)后表達、分泌的生物制品和直接采用動物組織原材料經(jīng)提取、純化制備的治療用生物制品常用滅活方法。從病毒滅活效果的角度看：pH越低、孵育溫度越高、孵育時間越長或者樣品濃度越低，則滅活效果越好。

納濾膜過濾法是當前可靠的病毒清除技術(shù)，主要基于尺寸排阻，利用病毒和蛋白大小的不同，小于平均孔徑的蛋白通過濾膜，大于平均孔徑的病毒截留在膜內(nèi)，對各類病毒（包膜病毒和非包膜病毒）達到有效清除。使用20nm左右的濾膜對生物制品溶液進行過濾，去除指數(shù)通?？梢赃_到4LRV以上，且不影響產(chǎn)品質(zhì)量，有效且穩(wěn)健。

利用病毒和目標產(chǎn)品在與層析介質(zhì)接觸時親和力或其他相互作用方面的差別，實現(xiàn)各種組分的分離。層析方法包括親和層析、陰或陽離子交換、復合模式層析等，Table 6列舉了這幾種層析方法去除病毒的能力。

層析技術(shù)去除病毒，需要考慮層析技術(shù)類型和層析填料使用次數(shù)（新、舊填料）對于去除病毒效果的差別，一般情況下，新舊填料的病毒清除能力沒有顯著差異。

藥品申報新藥研究申請 (Investigational New Drug, IND) 階段的要求主要體現(xiàn)在模型病毒的選擇、工藝選擇和工藝重復性3個方面。Table 7列舉了國內(nèi)外血液制品和抗體/重組蛋白制品在IND申報階段的要求。

Table 7. 國內(nèi)外IND申報病毒滅活/去除驗證要求

注：血制品中模型病毒選擇時，水皰性口炎病毒（VSV）耐受的pH范圍比較廣，驗證低pH孵育法滅活病毒效果時可選用此指示病毒。

藥品申報生物制品許可申請 (Biologics License Application, BLA) 階段的要求主要體現(xiàn)在指示病毒的選擇、工藝選擇和工藝重復性3個方面，同時要求更加嚴格。Table 8列舉國內(nèi)外血液制品和抗體/重組蛋白制品在BLA申報階段的要求。

Table 8. 國內(nèi)外BLA申報病毒滅活/去除驗證要求

工藝參數(shù)要求

由于在生產(chǎn)規(guī)模上進行病毒清除驗證研究是不現(xiàn)實的，驗證只能按照生產(chǎn)工藝的縮小規(guī)模進行。縮小模型在關(guān)鍵參數(shù)及控制條件方面應(yīng)與實際生產(chǎn)工藝嚴格保持一致。對于層析工藝，親和層析和陰離子層析表現(xiàn)出有效的病毒清除能力，因此這兩個層析步驟也常用于病毒清除驗證實驗。Table 9列舉了親和層析和陰離子層析（流穿模式）除病毒驗證中的最差工藝條件。

Table 9. 工藝參數(shù)要求

在病毒滅活/去除的工藝驗證中，病毒的檢測方法要求高靈敏度、高特異性以及很好的穩(wěn)定性和重復性。目前的病毒檢測方法主要為噬斑檢測法（定量）、細胞病變法（半定量）、核酸定量（定量檢測）。

每劑量病毒顆粒估算

Fig.3 計算模型逆轉(zhuǎn)錄病毒的安全系數(shù)的例子

參考文獻

[1] NMPA：生物組織提取制品和真核細胞表達制品的病毒安全性評價的技術(shù)審評一般原則，2005.12