以制備或分析為目的而澄清哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)液樣本，對(duì)后續(xù)的純化步驟及分析儀器的平穩(wěn)運(yùn)轉(zhuǎn)*。澄清步驟的總體目標(biāo)是去除細(xì)胞培養(yǎng)液中的細(xì)胞、細(xì)胞碎片及其它粒子，同時(shí)確保目標(biāo)產(chǎn)物得到足量回收。小體積（約小于25mL）澄清的常規(guī)程序是先對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)液樣本進(jìn)行離心，然后對(duì)離心后的上清液進(jìn)行微孔過(guò)濾。盡管離心去除了一些粗糙的高密度粒子，但通常需要微孔過(guò)濾來(lái)去除離心上清液中的小粒子或低密度粒子。通過(guò)采用孔徑為0.2或0.22μm的無(wú)菌級(jí)過(guò)濾器（稱(chēng)為除菌過(guò)濾器），微孔過(guò)濾還可同時(shí)發(fā)揮除菌滅菌的作用。

盡管離心步驟去除了絕大多數(shù)的粒子,但細(xì)孔過(guò)濾器往往會(huì)被堵塞，需要經(jīng)常更換。這樣一來(lái)，導(dǎo)致過(guò)濾器耗量增大，且不利于人體工學(xué)操作。然而，通過(guò)選擇恰當(dāng)?shù)尼橆^過(guò)濾器，可以減少過(guò)濾器耗量和相關(guān)操作時(shí)間。

本研究表明為CHO細(xì)胞培養(yǎng)液的澄清選擇恰當(dāng)?shù)尼橆^過(guò)濾器在提升樣本通量的同時(shí)，還能減少過(guò)濾器耗量，不會(huì)對(duì)濁度、單克隆抗體產(chǎn)物回收率或總產(chǎn)率產(chǎn)生負(fù)面影響。選擇市面上常見(jiàn)的兩種孔徑為0.22μm的無(wú)菌針頭過(guò)濾器。盡管這兩種過(guò)濾器的有效過(guò)濾面積存在輕微差異，但二者均有聚醚砜過(guò)濾膜。

為了改善細(xì)胞培養(yǎng)上清液的過(guò)濾以促進(jìn)細(xì)胞株的發(fā)育，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了比較研究。我們基于以下參數(shù)：濁度、單克隆抗體回收率、相對(duì)產(chǎn)率、通量及過(guò)濾器用量，對(duì)Acrodisc®（頗爾公司，訂單號(hào)：4652，有效過(guò)濾面積（EFA）=5.8cm²）和Minisart® High Flow （賽多利斯，訂單號(hào)：16532-K，EFA=6.2cm²）針頭過(guò)濾器的過(guò)濾性能進(jìn)行了研究。研究采用了從為期三個(gè)月的實(shí)際科研項(xiàng)目中采集到的CHO細(xì)胞培養(yǎng)液樣本。

在13個(gè)培養(yǎng)批次中，用到了十組目標(biāo)蛋白和培養(yǎng)方法（見(jiàn)表1）。此外，還使用了125mL和1000mL搖瓶，以及5L的攪拌式生物反應(yīng)器（賽多利斯 UniVessel）。采用貝克曼庫(kù)爾特公司的 Vi-CELL XR 檢測(cè)了細(xì)胞密度和存活率。作為目標(biāo)蛋白，用來(lái)自不同IgG1、IgG2、fc融合蛋白及雙特異性抗體的單克隆抗體篩選了CHO細(xì)胞株。基于保密協(xié)議，隱匿了后一種抗體的具體名稱(chēng)。

14天以后收集了所有的細(xì)胞培養(yǎng)批次；每一批次取兩份樣本（每種樣本多31mL），一份用Acrodisc®過(guò)濾器澄清，另一份用Minisart® High Flow過(guò)濾器澄清。先將兩份樣本（4000g）離心澄清60分鐘，然后將離心后的上清液分別用以上兩種針頭過(guò)濾器過(guò)濾（圖1）。
 

圖1：無(wú)菌條件下的初始澄清和隨后用孔徑為0.22μm的Minisart® High Flow針頭過(guò)濾器對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)上清液進(jìn)行除菌過(guò)濾。

分別在未收集到的細(xì)胞培養(yǎng)液和利用FortéBio公司裝有蛋白A生物傳感器（Pro A）的Octet QKe系統(tǒng)收集到的細(xì)胞培養(yǎng)液中測(cè)定單克隆抗體滴度，無(wú)需進(jìn)行任何麻煩的樣液制備。由測(cè)定的滴度計(jì)算回收率。

對(duì)體積介于25mL~30mL的不同樣液進(jìn)行比較后，即可計(jì)算出每份樣液的相對(duì)單抗產(chǎn)率（等式1）。

在澄清前后，用Lovibond公司的TurbiCheck WL 濁度計(jì)測(cè)量濁度值（白光光源）。然后，通過(guò)計(jì)算收集和未收集到樣液的濁度比測(cè)定降低的濁度。

本研究的目的是基于粒子減少、單抗回收率、產(chǎn)率和針頭過(guò)濾器耗量等參數(shù)，比較兩種不同針頭過(guò)濾器對(duì)澄清單抗上清液的適用性。

在實(shí)驗(yàn)中我們用到了多個(gè)培養(yǎng)體系和表達(dá)載體。利用這種方法獲得了一系列不同的活細(xì)胞數(shù)、存活率、濁度、單抗產(chǎn)物和滴度（表1）。尤其是，收集的細(xì)胞培養(yǎng)液的濁度介于457NTU和1431 NTU之間；活細(xì)胞數(shù)范圍：4 × 10⁶~16 × 10⁶個(gè)細(xì)胞/mL；存活率：48%~89%；單抗滴度（細(xì)胞培養(yǎng)液）：0.2 mg/mL~8.8 mg/mL。結(jié)果的多樣性是準(zhǔn)確說(shuō)明針頭過(guò)濾器適用性的前提條件。

為了確定粒子減少量，我們分別測(cè)定了細(xì)胞培養(yǎng)液和濾液的濁度。結(jié)果表明兩種過(guò)濾器均能去除上清液中的雜質(zhì)粒子。Acrodisc®過(guò)濾器過(guò)濾后的濾液平均濁度為17.7NTU；Minisart® High Flow過(guò)濾器過(guò)濾后的平均濁度為17.6 NTU。當(dāng)考慮整個(gè)澄清過(guò)程時(shí)，即將離心和過(guò)濾結(jié)合考慮，終結(jié)果為濁度相對(duì)降低93.8%到98.8%。濾液的濁度明顯不依賴(lài)于初始細(xì)胞培養(yǎng)液的濁度（圖2）。

圖2：濁度降低幅度[%]與未澄清細(xì)胞培養(yǎng)液濁度的關(guān)系圖。澄清過(guò)程包括離心和微孔過(guò)濾。濁度的降低不依賴(lài)于細(xì)胞培養(yǎng)液的濁度。這一點(diǎn)對(duì)Minisart® High Flow和Acrodisc®過(guò)濾器均適用（由于數(shù)據(jù)點(diǎn)幾乎重合，因此圖中未顯示）。

表1：不同樣液類(lèi)型（表達(dá)載體|單抗產(chǎn)物）及其參數(shù)概覽，如培養(yǎng)體系（STR = stirred tank reactor攪拌釜反應(yīng)器，SF = shake flask搖瓶）、14天后的活細(xì)胞數(shù)（VCC）和存活率，以及收集細(xì)胞培養(yǎng)液的濁度。同時(shí)采用兩種針頭過(guò)濾器進(jìn)行了澄清試驗(yàn)，以分別利用兩種過(guò)濾器進(jìn)行體積各異的澄清，從而獲得客觀(guān)的比較結(jié)果。

不同的細(xì)胞培養(yǎng)樣液產(chǎn)生了一系列不同的單抗滴度：0.2g/L~8.8g/L。兩種針頭過(guò)濾器品牌產(chǎn)生濾液的單抗滴度范圍均為0.2g/L~8.2g/L，終Minisart® High Flow過(guò)濾器的回收率介于89.9%到103.9%之間（平均回收率為97.7%），而Acrodisc®過(guò)濾器的回收率介于86.9%到107.3%之間（平均回收率為98.2%）。應(yīng)該強(qiáng)調(diào)的是，回收率不依賴(lài)于細(xì)胞培養(yǎng)液滴度（圖3）。這一點(diǎn)對(duì)不同濃度水平培養(yǎng)過(guò)程中單抗滴度的定期監(jiān)測(cè)非常重要。

圖3：?jiǎn)慰巩a(chǎn)物回收率[%]與未澄清細(xì)胞培養(yǎng)液?jiǎn)慰沟味鹊年P(guān)系圖；回收率不受針頭過(guò)濾器類(lèi)型的影響，Acrodisc®的平均回收率為98.2%，Minisart® High Flow的平均回收率為97.7%。細(xì)胞培養(yǎng)液滴度介于0.3g/L~8.8g/L之間時(shí)，未發(fā)現(xiàn)針頭過(guò)濾器的使用對(duì)單抗回收率有影響。
盡管外殼設(shè)計(jì)和每份樣液所用過(guò)濾器的數(shù)量有所差異，但對(duì)于兩種針頭過(guò)濾器來(lái)說(shuō)，每份樣液的相對(duì)產(chǎn)率均相同（圖4）。

圖4：多個(gè)單抗產(chǎn)物相對(duì)產(chǎn)率[%]的平均值。樣液的相對(duì)產(chǎn)率為濾液中單抗總量與未收集細(xì)胞培養(yǎng)液中單抗總量的比值。終結(jié)果表明，盡管針頭過(guò)濾器設(shè)計(jì)和過(guò)濾器用量有所差異，但兩種過(guò)濾器的相對(duì)產(chǎn)率相同。
為了比較通量和過(guò)濾器用量，我們?yōu)槊糠輼右捍_定了以下參數(shù)：上清液體積、總濾液體積以及所需的針頭過(guò)濾器數(shù)量。Acrodisc®的平均通量為9.3mL，Minisart® High Flow的平均通量為18.0 mL（圖5）。這種100%的差異無(wú)法用有效過(guò)濾面積（Acrodisc®: 5.8cm²，Minisart® High Flow：6.2cm²）的輕微差異解釋。這種現(xiàn)象更有可能是因?yàn)檫^(guò)濾器所用聚醚砜膜的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)存在差異所致。終發(fā)現(xiàn)Acrodisc®過(guò)濾器的平均使用率是每份樣液2.5個(gè)過(guò)濾器，Minisart ® High Flow的平均使用率是每份樣液1.4個(gè)過(guò)濾器。

圖5：CHO細(xì)胞培養(yǎng)上清液采用兩種不同的針頭過(guò)濾器（孔徑：0.22μm）過(guò)濾：賽多利斯 Minisart® High Flow 和頗爾公司 Acrodisc®。測(cè)定了每個(gè)針頭過(guò)濾器的平均通量。兩種過(guò)濾器的通量差異可能并非由有效過(guò)濾面積的差異所致（Acrodisc®: 5.8cm², Minisart® High Flow: 6.2cm²），可能的原因是過(guò)濾膜結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)的差異。

以上結(jié)果表明Minisart® High Flow過(guò)濾器的不堵塞過(guò)濾體積大于A(yíng)crodisc®，并且在濁度、單抗回收率及相對(duì)產(chǎn)率等參數(shù)中同樣體現(xiàn)出較高的性能。