反應(yīng)五要素:
參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+
引物:引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵,PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。理論上,只要知道任何一段模板DNA序列, 就能按其設(shè)計互補的寡核苷酸鏈做引物,利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增。設(shè)計引物應(yīng)遵循以下原則:
①引物長度: 15-30bp,常用為20bp左右。
②引物擴增跨度: 以200-500bp為宜,特定條件下可擴增長至10kb的片段。
③引物堿基:G+C含量以40-60%為宜,G+C太少擴增效果不佳,G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC隨機分布,避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu),避免兩條引物間互補,特別是3'端的互補,否則會形成引物二聚體,產(chǎn)生非特異的擴增條帶。
⑤引物3'端的堿基,特別是末及倒數(shù)第二個堿基,應(yīng)嚴格要求配對,以避免因末端堿基不配對而導(dǎo)致PCR失敗。
⑥引物中有或能加上合適的酶切位點, 被擴增的靶序列有適宜的酶切位點, 這對酶切分析或分子克隆很有好處。
⑦引物的特異性:引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性。
引物量:每條引物的濃度0.1~1umol或10~100pmol,以低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好,引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增,且可增加引物之間形成二聚體的機會。
產(chǎn)品名稱 | 中山病毒PCR檢測試劑盒價格 |
英文名稱 | Chuzan VirusRTPCR |
分類 | PCR檢測試劑盒 |
特點:
高特異性:與其他病毒無交叉反應(yīng),無非特異性擴增;
高靈敏度:檢測靈敏度可達10~100;
操作簡便:該系列所有試劑均采用相同的體系和條件,可同時進行多個檢測;
高通量:多種雙重PCR檢測以及三重PCR檢測試劑盒。
樣品 DNA 的制備:
1.用自選方法純化樣品的 DNA,本試劑盒跟市場上大多數(shù)病毒 DNA 提取試劑盒兼 容。。也可以選購本公司的一管式病毒 DNAout 或其升級版柱式病毒 DNAout。 本試劑盒免費贈送 15 次 DNA 病毒裂解液試用裝(一管式病毒 DNAout 的成分)。
稀釋陽性對照(以 10E2-10E7 這 6 個 10 倍稀釋度為例。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高,因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行,千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分)。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原,本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照,只提供可以直接使用的長為 86bp 的 DNA 片段作為陽性對照。
2.標(biāo)記 6 個離心管,分別為 7,6,5,4,3,2。
3.用帶芯槍頭分別加入 45 μL 模板稀釋液(用帶芯槍頭,下同)。
4.在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照,充分震蕩 1 分鐘,得1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。5.換槍頭,在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),充分震蕩 1 分鐘,得 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。
6.換槍頭,在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照到 5 號管中,充分震蕩 1 分鐘,得 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。
7.換槍頭,在 4 號管中加 5 μL 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照到 4 號管中,得1×10E4 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。8.重復(fù)上面的操作直到得到 6 個稀釋度的陽性對照。放冰上待用。
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使用及效果:
PCR反應(yīng)特點
(1) 特異性強
PCR反應(yīng)的特異性決定因素為:
①引物與模板DNA特異正確的結(jié)合;
②堿基配對原則;
③Taq DNA聚合酶合成反應(yīng)的忠實性;
④靶基因的特異性與保守性。
其中引物與模板的正確結(jié)合是關(guān)鍵。引物與模板的結(jié)合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對原則的。聚合酶合成反應(yīng)的忠實性及Taq DNA聚合酶耐高溫性,使反應(yīng)中模板與引物的結(jié)合(復(fù)性)可以在較高的溫度下進行,結(jié)合的特異性大大增加,被擴增的靶基因片段也就能保持很高的正確度。再通過選擇特異性和保守性高的靶基因區(qū),其特異性程度就更高。
(2) 靈敏度高
PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的,能將皮克(pg=10-12g)量級的起始待測模板擴增到微克(ug=10-6g)水平。能從100萬個細胞中檢出一個靶細胞;在病毒的檢測中,PCR的靈敏度可達3個RFU(空斑形成單位);在細菌學(xué)中zui小檢出率為3個細菌。
(3) 簡便、快速
PCR反應(yīng)用耐高溫的Taq DNA聚合酶,一次性地將反應(yīng)液加好后,即在DNA擴增液和水浴鍋上進行變性-退火-延伸反應(yīng),一般在2~4 小時完成擴增反應(yīng)。擴增產(chǎn)物一般用電泳分析,不一定要用同位素,無放射性污染、易推廣。
(4) 對標(biāo)本的純度要求低
不需要分離病毒或細菌及培養(yǎng)細胞,DNA 粗制品及總RNA均可作為擴增模板??芍苯佑门R床標(biāo)本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細胞、活PCR技術(shù)概論。
MESDC2/MESD抗體,兔多抗,抗原親和純化10236-47-2HPLC≥98%A014620mg/支WB IP 柚皮苷
人白細胞分化抗原8(CD8)ELISA試劑盒97-53-0 20mg Eugenol 0.312-20 ng/mL丁香(含量)
CD38抗體,兔多抗167775-54-4 C31H48O43-Epidehydrotumulosic acid HPLC≥98%ELISA 3-表去氫土莫酸
ELISAKitforHumanAlpha-galactosidaseA10mg Tuberostemonine trifluoroacetate 0.156-10 ng/mL對葉百部堿三乙酸鹽
新生霉素10062 4.5mg/支*5乙酰輔酶A
人鎳紋樣蛋白(Meteorin-likeprotein)ELISA試劑盒1g 78-5000 pg/mL3,3'-二吲哚烷 DI-INDOLYLMETHANE, 3,3'-(RG)
BCG牛培養(yǎng)基K-INTDF 250g綜合總膳食纖維檢測試劑盒K-INTDF
ELISAKitforHumanCoronin-1A751-03-1 20mg Obacunone 0.156-10 ng/mL黃柏
HE瓊脂/Hektoen瓊脂培養(yǎng)基/腸道病菌培養(yǎng)用瓊脂/HektoenEntericAgar500-22-1用于沙門氏菌屬和志賀菌屬的分離培養(yǎng)供應(yīng) 3-啶 500-22-1
人尿皮質(zhì)素2(UCN2)ELISA試劑盒5mg 31.2-2000 pg/mL氯化黃連堿 COPTISINE CHLORIDE(RG)(PLEASE CALL)
小鼠狀腺成纖維細胞 20mg HPLC≥98%Cimifugin用于含量測定5 x 10^5 cells/T25培養(yǎng)瓶升麻素
ZMYM2抗體,兔多抗,抗原親和純化20mg/支HPLC≥98%524-17-4IHC-P 蝙蝠葛堿
ELISAKitforHumanBeclin-1554-84-1 20mgParthenolide HPLC≥98% 0.312-20 ng/mL小白菊內(nèi)酯
PTPN2/TC-PTP抗體,兔多抗,抗原親和純化537-73-50.97A050920mg/支ELISA WB IP 異阿魏酸
ELISAKitforHumanBcl2antagonistofcelldeath479-98-1 20mgAucubin HPLC≥98% 0.312-20 ng/mL桃葉珊瑚苷;珊瑚木苷;杜仲苷
FGFR3/CD333抗體,兔多抗,抗原親和純化673-22-3C8H8O34-Methoxysalicylaldehyde≥98%ELISA 4-氧基水楊
中山病毒PCR檢測試劑盒價格升麻-3-O-β-D-木糖苷;升麻環(huán)氧苷 HPLC≥98% Cimigenol-3-O-β-D -xylpyranoside 小鼠角膜基質(zhì)細胞 用于含量測定
高三尖杉酯堿;高粗榧堿,高哈林通堿 HPLC≥98% Homoharringtonine 大鼠舌表皮細胞 用于含量測定
羥基積雪草苷 20mg Madecassic acid ELISAKitforHumanDisabledhomolog1
CHEIROLIN(RG)(PLEASE CALL) 人核連蛋白2ELISA試劑盒
D-Raffinose 棉籽糖 10g 吖啶黃素(5.0mg)
木通苯乙苷B C23H26O11 Calceorioside B IMP1/IMPA1抗體,兔多抗,抗原親和純化 ≥98%
新異甘草苷 HPLC≥98% Neoisoliquiritin 人肝癌細胞,SNU387細胞 新異甘草苷 7014-39-3
棕櫚酸咖 CAFESTOL PALMITATE(RG) 10mg EstrogenReceptoralpha抗體,兔單抗